Özet

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

Published: March 04, 2015
doi:

Özet

Здесь мы приводим протокол для употребления инъекционных ультразвуковые микропузырьков контрастных агентов в живую, изолированных поздно созревания эмбрионов на стадии мышиных. Этот метод позволяет изучать параметров перфузии и сосудистых молекулярных маркеров в пределах эмбриона с использованием высокочастотного изображений контрастным усилением УЗИ.

Abstract

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introduction

Контрастное ультразвуковое исследование использует микропузырьков контрастных агентов для визуализации и характеризуют сосудистой оболочке. Эти агенты позволяют неинвазивного оценку микроциркуляции, кровеносных сосудов и сердечно-сосудистой системы. Кроме того, модификация поверхности пузырька может привести к целевой микропузырьков связывания с эндотелиальными биомаркеров, как показано в доклинических приложений ангиогенеза, атеросклероза и воспаления 1,2 делая молекулярную ультразвуковой визуализации сосудистых событий возможных. Поэтому Контраст усиливается ультразвук может быть использован для идентификации сложные и разнообразные среды, влияющие на здоровых и больных сосудистые состояния 3-5.

В последние несколько лет интерес к полезности изображений микропузырьков расширилась до универсала модели мышиного эмбриона. В качестве модели развития млекопитающих, введение микропузырьков в эмбриональном сосудистой повышает физиологическиеИсследование развивающихся сердечно-сосудистой системы (например, потока крови, сердечный выброс) и в тех случаях, трансгенных и целевых мутантных мышах болезни сердца 6,7, может дать представление о том, как генетические факторы изменения сердечно-сосудистой системы. В самом деле, количественный и качественный 2D анализ эмбрионального сосудистой мозговой уже достигнуты 8. Кроме того, эмбрион мыши представляет как прекрасным примером для изучения связывания целевых микропузырьков сосудистых маркеров в естественных условиях. Bartelle и др. 9, например, ввели авидин микропузырьков в зачаточном желудочков сердца с целью оценки целенаправленное связывание в Biotag-Бира трансгенных эмбрионов и изучить сосудистую анатомию. Поколение гетерозиготных и гомозиготных мышиных моделях может быть также использован в качестве суррогата модели опухоли исследований, направленных на определение количественного природы молекулярного УЗИ – важный ориентир в переводе эту технику в клинику.

<p clосел = "jove_content"> Микропузырьки наиболее часто вводят в эмбриональном обращении через внутри-сердечной вливаний в отдельных эмбрионов, которые открыты в лапаротомии 8-10. В утробе матери инъекций, однако, сталкиваются с целым рядом проблем. Они включают в себя инъекции руководство, необходимость борьбы с движением у матери и экстериоризированного эмбриона, поддержание гемодинамики жизнеспособности у матери и выводили эмбрионов, обращаясь долгосрочные последствия анестезии и осложнения, связанные с кровотечением 11. Таким образом, цель исследования состояла в разработке методики для введения микропузырьков в изолированных жилых поздней стадии эмбрионов 12. Эта опция предлагает больше свободы в плане управления впрыском и позиционирования, воспроизводимости плоскости изображения, без препятствий, и упрощенного анализа изображений и количественной оценки.

В настоящем исследовании мы опишем новый порядок введения микропузырьков в живых эмбрионов мышей FOR целях изучения микропузырьков кинетическое поведение и изучения целевой микропузырьков связывания эндогенных эндотелиальных поверхностных маркеров. Нелинейная конкретных изображений контраст УЗИ используется для измерения ряда основных параметров перфузии в том числе пик повышения (PE), промыть в скорости и времени до пика (ТТП) в изолированных зародышей E17.5. Мы также продемонстрировать справедливость модели эмбриона для оценки количественной природы молекулярной ультразвука в эмбриональной потере эндоглин функции трансгенных мышах, где эндоглин является клинически значимым целевой благодаря своей высокой экспрессии в эндотелиальных клетках сосудов в местах активного ангиогенеза 13 , Адгезия эндоглина ориентированные (MB E), крысы изотипического IgG 2 управления (MB C) и нецелевые (MB U) микропузырьков оценивали в гетерозиготном эндоглина (Eng +/-) и гомозиготной эндоглина (Eng + / +), выражающая эмбрионов. Анализ целевого биндинг показывает, что молекулярная УЗИ способны дифференцироваться между эндоглина генотипов и относящихся плотности рецепторов к количественному уровнях молекулярных ультразвука.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментальные методики, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в Sunnybrook научно-исследовательского института (Торонто, Онтарио, Канада) на. Процедуры для гуманного обращения с животными должны соблюдаться во все времена. Предполаг…

Representative Results

Инъекция ультразвуковых контрастных агентов в бывших маточно мышиных эмбрионов зависит от успешного выделения живых, в конце гестационного эмбрионов на стадии от матки и поддержание жизнеспособности в течение курса инъекций и связанной изображений ультразвука. После того, как ?…

Discussion

Ультразвуковые контрастные агенты вводили в поздней стадии эмбрионов беременность мыши и нелинейных контрастных изображений были приобретены для измерения параметров перфузии и целевых микропузырьков обязательными. Успешное изображений микропузырьков в пределах эмбрионального с…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.

Materials

Reagents Company Catalog Number Comments/Description
Antibodies (biotinylated, eBioscience) Antibody choice depends on the experiment
      rat isotype IgG2 control eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
      biotin anti-mouse CD309 eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
     500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose Sigma D5796
     50 mL Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020 lot # 7592456
     Hepes  Gibco 15630 5mL, 1M
     Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140-122 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100×20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60×15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 mL BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8x magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 mL Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 mL VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110oC VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

Referanslar

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images – Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. . 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, t. e. n., P, L. J. A. C., Hawinkels, Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. . Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre, ., Y, , et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. . Live imaging of mouse embryos. 4 (4), 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

View Video