Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Carmen G. Tag; Sibille Sauer-Lehnen; Sabine Weiskirchen; Erawan Borkham-Kamphorst; Ren&#233; H. Tolba; Frank Tacke; Ralf Weiskirchen

doi:10.3791/52438

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Tıp

Ligadura del conducto biliar en los ratones: Inducción de la injuria hepática inflamatoria y fibrosis por colestasis obstructiva

Published: February 10, 2015

doi:

10.3791/52438

Carmen G. Tag¹, Sibille Sauer-Lehnen¹, Sabine Weiskirchen¹, Erawan Borkham-Kamphorst¹, René H. Tolba², Frank Tacke³, Ralf Weiskirchen¹

¹Institute of Molecular Pathobiochemistry, Experimental Gene Therapy and Clinical Chemistry,RWTH Aachen University, ²Institute for Laboratory Animal Science and Experimental Surgery,RWTH Aachen University, ³Department of Medicine III,RWTH Aachen University

Özet

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Abstract

En la mayoría de los vertebrados, el hígado produce la bilis que es necesario para emulsionar las grasas absorbidas y permitir la digestión de lípidos en el intestino delgado, así como para excretar bilirrubina y otros productos metabólicos. En el hígado, la obstrucción experimental del sistema biliar extrahepática inicia una compleja cascada de eventos patológicos que conduce a la colestasis y la inflamación que resulta en una reacción fibrótica fuerte procedente de los campos periportal. Por lo tanto, la ligadura quirúrgica del conducto biliar común se ha convertido en el modelo más utilizado para inducir lesión colestásica obstructiva en los roedores y estudiar los eventos moleculares y celulares que subyacen a estos mecanismos fisiopatológicos inducidos por el flujo de la bilis inapropiado. En los últimos años, diferentes técnicas quirúrgicas han descrito que, o bien permitir la reconexión o reanastomosis después de la ligadura del conducto biliar (BDL), por ejemplo, BDL parcial, u otros métodos de microcirugía para preguntas específicas de investigación. Sin embargo, el modelo más utilizado es la obstrucción completa del conducto biliar común que induce una fuerte respuesta fibrótica después de 21 a 28 días. La tasa de mortalidad puede ser alta debido a complicaciones infecciosas o inexactitudes técnicas. Aquí proporcionamos un procedimiento quirúrgico detallado para el modelo BDL en ratones que inducen una respuesta fibrótica altamente reproducible de acuerdo a la regla 3R para el bienestar animal postulado por Russel y Burch en 1959.

Introduction

La fibrosis hepática se define como la producción excesiva y la acumulación de la matriz extracelular (ECM) que se origina en una red compleja de interacciones de las células estrelladas hepáticas matriz producción y una amplia variedad de células de la sangre células infiltrantes de hígado de residentes y ^1,2. Aunque la fibrosis hepática puede ser causada por una multitud de diferentes estímulos de los mecanismos moleculares que subyacen a la fibrosis son generalmente muy similar. Después de daño hepático, se inicia un programa altamente orquestada de cambios moleculares y celulares. En este programa una estrecha interacción entre inflamatorias señales, monocitos / macrófagos y las células estrelladas hepáticas se produce que en los resultados finales en la activación de las células estrelladas y transdiferenciación a miofibroblastos, la deposición de ECM y alteraciones anatómicas y funcionales consecutivos de la integridad del tejido del hígado ^3. La activación de las células estrelladas hepáticas está especialmente impulsada por las señales inflamatorias e interacciones con el hígadomacrófagos residental_nup (es decir, las células de Kupffer). Patrones moleculares asociados a patógenos son reconocidos por receptores especializados de reconocimiento de patrones, tales como los receptores Toll-like que cuando se activa la señal a través de una red compleja de diferentes vías que activan la expresión y secreción de una multitud de citoquinas inflamatorias y quimiocinas que impulsan el proceso inflamatorio ^3. La respuesta inflamatoria y el insulto hepática formado es sólo temporal cuando se retira el factor que produce la enfermedad. En contraste, si la lesión persiste, la inflamación crónica evoluciona en el hígado y la expresión y la acumulación de multitudes de ECM en el primer plano que resulta en la sustitución progresiva del parénquima hepático normal por la formación de tejido de cicatriz.

Desde la fibrogénesis hepática en los seres humanos es un problema clínico en todo el mundo, se han establecido varios modelos de roedores experimentales de insuficiencia hepática aguda y crónica durante las últimas décadas. En las musistema de Rine por ejemplo, modelos comunes son la administración de una variedad de diferentes hepatotoxinas, la ligadura del conducto biliar común, la inducción de la lesión hepática mediada inmunológicamente, y la introducción selectiva de defectos genéticos o viceversa la sobreexpresión de transgenes que afectan crítico vías de señalización implicadas en la patogénesis de la fibrosis hepática ^4.

La ligadura del conducto biliar común en los roedores se ha llevado a cabo como un procedimiento experimental en la investigación durante muchos años ^5-8. Un primer protocolo altamente reproducible para la ligadura del conducto biliar prolongada (BDL) en roedores ya fue presentado hace ya más de tres décadas ^9. En este protocolo tanto canulación / obstrucción y la ligadura indujeron un alto rendimiento de cirrosis en ratas con cambios morfológicos que fueron comparables a los observados en la cirrosis biliar humano ^9. El protocolo respectivo es simple, el procedimiento quirúrgico es relativamente rápidamente aplicable, Y las tasas de supervivencia de los animales son altos con más del 95%. En el protocolo de rata canulación / obstrucción clásica, se hace una pequeña incisión de 2 cm justo debajo de la apófisis xifoides. A partir de entonces, una cánula se inserta en la porción proximal del conducto biliar y se fija en su posición con suturas de seda. En un siguiente paso, la porción distal de la cánula está obstruido con 3 nudos, poner través del extremo inferior de la incisión en la línea media y enterrado por vía subcutánea en el cuadrante inferior derecho ^9. Al final, se cierra el abdomen y los animales se les permite recuperarse. En el protocolo de la ligación, las ratas se someten a una doble ligadura del conducto biliar común, ya sea con o sin disección del conducto biliar entre las ligaduras ^9.

Este modelo experimental es bien aceptado y utilizado en todo el mundo en cientos de laboratorios para inducir colestasis hepática y fibrosis. Se induce la proliferación de células epiteliales biliar intrahepática, differentiatio miofibroblásticon de fibroblastos portales alrededor de la proliferación de células epiteliales biliares, lo que resulta en una expresión masiva altamente reproducible y la deposición de ECM ^10,11. Por lo tanto, la aplicación de este modelo en ratas y ratones es ser popular entre los científicos que tratan de entender la patogénesis de la inflamación hepática y fibrosis.

En nuestro laboratorio, hemos utilizado ampliamente este protocolo en el pasado en las ratas en varios estudios experimentales con el objetivo de investigar aspectos moleculares y celulares especiales de la fibrogénesis hepática y para probar nuevos conceptos antifibróticas y fármacos ^12-15.

Recientemente, hemos adaptado esta metodología al sistema murino y encontramos que la cirugía de ligadura del conducto biliar es también un medio atractivo para establecer fibrosis dependiente del tiempo con baja variación y la mortalidad en ratones ^16-18. Debido al tamaño más pequeño de los animales, sin embargo, algunas modificaciones importantes con respecto a la anestesia, interv quirúrgicaención y observación post-tratamiento son necesarias para obtener resultados fiables y reproducibles en este modelo. La adaptación completa se resume en el siguiente protocolo y en la documentación de vídeo adjunto.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el cuidado de los animales Estado y el uso comité oficial (LANUV, Recklinghausen, Alemania). Los ratones son alojados en condiciones libres de patógenos específicos de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA). Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la ley federal alemana sobre protección de los animales y la 'Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio "(National Institutes of Health publicación 8ª edición, 2011). 1. Preparación prequirúrgica NOTA: Llevar a cabo todos los procedimientos en condiciones limpias, pero no estériles. Todos los instrumentos y otros equipos reutilizables tales como pinzas quirúrgicas, tijeras y Colibri retractor que se utilizan para realizar la cirugía deben ser esterilizados antes de su uso de acuerdo con los protocolos que están en estricto cumplimiento de las directrices institucionales para la realización de cirugías en animales.; Para obtener una lista detallada de los reactivos necesarios, materiales y equipos, por favor consulte la lista de los Materiales Específicos / Equipo. Durante la experimentación completa, mantener al animal en una placa de calentamiento a una temperatura de 37 ° C, conectada permanentemente a un sistema de anestesia, y la cubierta de la zona de operaciones en general con impermeables a los fluidos, cortinas autoadhesivas. Adecuadamente organizar todos instrumentaciones y soluciones que se utilizan durante la experimentación antes de la cirugía (Figura 1). Anestesiar al ratón con la inhalación de 4 vol% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 4 L / min para la inducción de la anestesia. La profundidad de la anestesia es suficiente cuando se alcanzan los siguientes criterios vitales: respiración regular espontánea, sin reflejo después de establecer de estímulos de dolor entre los dedos de los pies, y no hay respuesta al dolor. Afeitarse la piel abdominal del ratón con una máquina de afeitar eléctrica de la piel y proteger los ojos se sequen por el uso del ojo y nungüento ose. Coloque el ratón sobre una placa caliente calentada 37 ° C, inserte el hocico del ratón en la máscara Fluovac del sistema de anestesia Fluovac, y fijar las patas del animal con rayas de cinta de seda. Mantener la anestesia del ratón por la inhalación de 1,5-3% en volumen de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 1 L / min y inducir analgesia perioperatoria a través de inyección intraperitoneal de la solución de buprenorfina (0,1 mg / kg BW disolvió en solución de NaCl al 0,9%) . Esterilizar la piel abdominal afeitada con una torunda de gasa que se humedece con un estándar antiséptico, listo para usar solución alcohólica para el tratamiento preoperatorio de la piel. Nota: En nuestros protocolos utilizamos un antisepticum piel poli-alcohol. Esto está en total acuerdo con la ley federal alemana sobre protección de los animales y las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio. Este antiséptico contiene 70% (v / v) 2-propanol, butan-1,3.diol y trazas de amarillo de quinoleína, y perfumee. 2. Procedimientos Quirúrgicos Abrir el abdomen con una laparotomía de la línea media de una longitud de aproximadamente 2 cm cortando el cutis más fascia al mismo tiempo con una tijera quirúrgica 11,5 cm. Diseccionar el tejido conectivo en la parte superior del peritoneo mediante el uso de la tijera como un esparcidor. Cortar el peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir la cavidad peritoneal. Ampliar la cavidad mediante la inserción de una sutura de retención en el esternón, elevando el filamento de la sutura, y la fijación en la parte superior de la máscara Fluovac. Extender el área de operación mediante la inserción de un retractor Colibri en la cavidad peritoneal (Figura 2). Levantar el hígado con una hidratada (0,9% NaCl solución) hisopo de algodón para que el lado ventral de que se pega a la membrana y el hilio es claramente visible. Exponer la vía biliar por el movimiento caudal del intestino (Figura 3). Separar cuidadosamente el conducto de la bilis desde elflanqueando la vena porta y la arteria hepática utilizando un fórceps micro-dentados (Figura 4A). Coloque el 5-0 sutura alrededor del conducto biliar y fijarlo con dos nudos quirúrgicos. Al atar los nudos aumentan la fuerza de tracción continua para garantizar la obstrucción efectiva sin cortar el conducto biliar (Figura 4B). Añadir una segunda ligadura craneal de la misma manera pero no diseccionar el conducto biliar en el medio (Figura 4C). De lo contrario, existe un riesgo considerable de que las fugas biliares si un nudo no es seguro, y los animales no experimentan colestasis pero desarrollan peritonitis graves. Corte los extremos de las suturas (Figura 4D), bajar el esternón, y retire el retractor. Enjuague la cavidad peritoneal con solución de NaCl 0,9% y reemplazar los órganos abdominales a las posiciones fisiológicas. Cierre las dos capas abdominales (peritoneo y cutis más facia) con suturas continuas separadas con 6-0 Mersilk. Cortar el correonds de las suturas y esterilizar el área de operación con un hisopo de gasa humedecida con solución antiséptica. NOTA: Al realizar la cirugía, por primera vez, lleve a cabo todos los procedimientos en virtud de un microscopio quirúrgico con un aumento de 16X-20X. Esto permite un mejor reconocimiento de la vía biliar y claramente distingue de la vena porta y la arteria hepática (Figuras 5 y 6). Algunos laboratorios recomiendan la disección del conducto biliar entre las dos ligaduras. Deja el conducto biliar intacta porque potenciales fugas en uno de los nudos se traducirá en una peritonitis aguda grave, ascitis y endotoxemia sistémica cuando se diseca el conducto biliar. 3. Postoperatorio Tratamiento y Seguimiento Deje que el ratón se recupere en una jaula calentado por una lámpara de infrarrojos hasta que el ratón está totalmente despierto y activo. Después, mueva el ratón a una jaula normal y proporcionar acceso ad libitum a agua y alimentos. Laespués de la cirugía, monitorear los animales a intervalos regulares y llevar a cabo el tratamiento postoperatorio de seguimiento con analgesia adecuada (por ejemplo, solución de buprenorfina) siguiendo la recomendación local del cuidado de los animales y el uso interno de los comités. NOTA: Realice la terapia analgésica durante 3 días. Cualquier comportamiento anormal puede indicar complicaciones poco frecuentes, como peritonitis, sepsis o hemorragia interna y debe ser manejado como criterio de valoración humana para terminar el experimento. Los animales se mantienen con libre acceso al alimento y agua ad libitum hasta el final del experimento. No hay necesidad de la extracción de sangre desde la fibrogénesis en curso se indica por la ictericia. Cuando los animales se sacrifican, se recoge sangre para la medición de parámetros clínicos de química (AST, ALT, bilirrubina, etc.) y el hígado se recupera para el análisis histoquímico y bioquímica.

Representative Results

En un experimento típico BDL se realizó en 40 ratones macho C57BL / 6 de tipo salvaje que pesan unos 18-20 gramos. Este experimento se realizó para investigar la fibrogénesis hepática en la fase de iniciación (3 y 7 días), durante la progresión (10, 14, y 20 días), y durante largo plazo (30 y 60 días) 16. En este modelo, fibrosis persinusoidal ya ha desarrollado en el día 10 después de la cirugía, mientras que la fibrosis periportal que permanentemente incrementa hasta el final del experimento fue desarrollado por completo después de 20 días. En el experimento mencionado, todos los animales que recibieron una sencilla operación simulada sobrevivieron, y sólo dos de los 40 ratones (5%) que recibieron BDL desarrollaron un mal estado general y por lo tanto se sacrificaron prematuramente antes del punto final prevista del experimento. La actividad de los animales con operación simulada fue sin excepción ya la normalidad un día después de la laparotomía, mientras que la mayoría de los animales sometidos a BDL mostraron una actividad reducida durante los tres primeros días. Jpiel aundiced había sido ya evidente en todos los animales BDL uno o dos días después de que el establecimiento de la BDL 16. Los valores tanto de la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) que representan los marcadores séricos bien establecidos de la lesión hepática aumentó rápidamente y alcanzó su punto máximo durante el día 7 y el día 20 después de BDL (Tabla 1). A partir de entonces, ALT y AST disminuyeron constantemente hasta el día 30 y se mantuvo estable hasta 60 días después de la cirugía. En línea con la lesión colestásica, las concentraciones séricas de la bilirrubina total fueron constantemente elevada y alcanzó una meseta después de 7 días 16. Tiempo similar de actividades de ALT y AST en suero también se registraron para las ratas que fueron sometidos a BDL. En un estudio reciente se demuestra que los niveles de AST y ALT sérica aumentó hasta 5 o 10 veces mayor de lo normal en la primera semana después de la cirugía BDL y la disminución después de dos semanas 19. Típicamente, los hígados de los animales con operación simulada todavía se ven smooth al final del experimento, mientras que los hígados de los animales que recibieron BDL muestran alteraciones de la arquitectura que se caracterizan principalmente por la formación de edema y fibróticas nódulos en la superficie del hígado y la hidropesía de la vesícula biliar que está lleno de grandes cantidades de las correspondientes biliar (Figura 7). Las alteraciones morfológicas características del hígado que son inducidos por la cirugía BDL también son demostrables en el análisis histológico estándar (Figura 8). En el mismo conjunto de experimentos, el desarrollo de la fibrosis hepática fue semi-cuantitativamente evaluado sobre la base de la histología hepática evaluado por un patólogo ciego utilizando un sistema de puntuación en el que la fibrosis periportal fue puesta en escena de 0-4 y fibrosis perisinusoidal 0-2, dando un máximo valor que era equivalente a la cirrosis 6. Como era de esperar, el índice de fibrosis de media en el grupo de animales con operación simulada fue de 0,00 ± 0,00. En contraste, en el grupo de animales tsombrero recibió BDL, la puntuación aumentó de manera constante hasta el día 60 a un valor de 4,83 ± 0,17. Se alcanzó el máximo de 3 para la fibrosis periportal en el día 20. En todos los animales analizados, fibrosis perisinusoidal estuvo ausente durante los primeros 10 días del experimento y fue en primer lugar notable después de dos semanas. A partir de entonces, aumentó de manera constante hasta el final del experimento para valores de 1,8 ± 0,17 (Tabla 1). También en varios otros experimentos con animales independientes que se realizaron, se observó que la formación de fibrosis estaba mostrando aumento dependiente del tiempo altamente reproducible de la expresión de colágeno y la deposición intrahepática como consecuencia de la fibrogénesis en curso (Figura 9). Del mismo modo, el proceso de fibrogénesis en curso es notable en elevada expresión de α-actina de músculo liso (α-SMA) que representa un marcador de células fibroblásticas, es decir, activa las células estrelladas hepáticas y miofibroblastos portal,e hidroxiprolina hepática, un aminoácido encontrado en abundancia en las matrices de colágeno 18 (Figura 9). Además, la expresión de vimentina que indica cantidades de miofibroblastos o fibroblastos aumento se incrementa después de ajustar de la cirugía BDL 20. La concomitancia de la inflamación en el hígado de heridos se reflejan aún más por el aumento de expresión de Lipocalina 2 (LCN2) que se induce fuertemente durante la lesión hepática aguda y crónica y evoluciona efectos hepato-protectora durante la lesión hepática aguda 21,22. Las células inflamatorias que se infiltran en los hígados de los animales que recibieron BDL pueden ser detectados por tinción específica con un anticuerpo que es específico para CD45 (Figura 10). Este marcador de superficie celular que también se conoce como PTPRC (proteína tirosina fosfatasa, de tipo receptor) se expresa específicamente en todas las células hematopoyéticas diferenciadas, excepto los eritrocitos y células plasmáticas. <table fo:keep-together.within-page = "border" > Tiempo después de la ligadura del conducto biliar (días) La bilirrubina total AST (U / L) ALT (U / L) Portal de la fibrosis Fibrosis perisinusoidal Puntuación total (Mg / dL) 0 (n = 3) 0.17 ± 0.06 192,67 ± 30,50 50.33 ± 6.03 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 3 (n = 5) 6.85 ± 2.21 1.159,25 ± 319,27 566,50 ± 335,25 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 7 (n = 5) <td> 14.38 ± 2.14 ± 976,60 ± 477,16 448,20 ± 259,47 0.60 ± 0.25 0.0 ± 0.0 0.60 ± 0.25 10 (n = 5) 15,92 ± 2,60 1.916,60 ± 868,25 560,40 ± 80,88 1.40 ± 0.25 0.25 ± 0.25 1,67 ± 0,25 14 (n = 5) 17,90 ± 3,84 1.088,60 ± 276,32 505,00 ± 96,15 ± 2,4 ± 0,25 1,0 ± 0,0 3.40 ± 0.24 20 (n = 4) 18,00 ± 2,12 1.072,67 ± 364,27 404.00 ± 195.48 3,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 4.0 ± 0.0 30 (n = 5) 16,04 ± 4,79 446,40 ± 169,75 260,20 ± 126,97 2,8 ±; 0.2 1,4 ± 0,25 4.20 ± 0.20 60 (n = 6) 16,02 ± 1,19 484,67 ± 117,79 257,17 ± 50,97 3,0 ± 0,0 1,8 ± 0,17 4,83 ± 0,17 Las abreviaturas utilizadas son: ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa. Tabla 1: Fibrosis anotando en un experimento representativo Los datos de esta tabla se reproducen a partir de un estudio en el que la fibrosis hepática inducida por ligadura del conducto biliar en ratones C57BL / 6 16.. En este estudio, la tasa de mortalidad después de la cirugía BDL fue del 5% (2 de 40 animales fueron sacrificados antes de tiempo debido a las condiciones de policía pobres desarrollados). Figura 1: Montaje experimental para la realización de una bilisligadura del conducto. El animal se mantiene en una placa de calentamiento a una temperatura de 37 ° C y la zona de operaciones está cubierto en general con impermeables a los fluidos, cortinas autoadhesivas. Durante la cirugía completa, el animal está permanentemente conectado a un sistema de anestesia. Todas las instrumentaciones y soluciones (analgésicos, anestésicos, solución antiséptica, 0,9% NaCl) se disponen con claridad. Figura 2:. Preparación de la zona de la cirugía de la apertura previa de la cavidad peritoneal, la piel abdominal debe ser afeitado con una máquina de afeitar eléctrica de la piel y desinfectado con un hisopo de gasa antiséptica. El área de la cirugía se cubre entonces con impermeables a los fluidos, cortinas autoadhesivas. El abdomen se abre con una laparotomía media (~ 2 cm de longitud). La cavidad se amplía mediante la inserción de una sutura sosteniendo en el esternón y el área de operación extendido porla inserción de un retractor Colibri permitiendo la experimentación sin obstáculos durante la cirugía. Figura 3: La exposición de la vía biliar. (A) Para llevar a cabo la ligadura del conducto biliar, el lado ventral del hígado se levanta de manera que pueda pegarse a la membrana y el hilio hepático hace claramente visible. (B) Para exponer mejor el conducto biliar, el intestino se mueve con caudalmente un hisopo de algodón humedecido. El conducto biliar está marcado con una flecha. Figura 4: ligar el conducto biliar. (A) En una primera etapa, el conducto de la bilis se separa cuidadosamente de la flanqueando la vena porta y la arteria hepática utilizando un fórceps micro-dentado. (B) Posteriormente, un hilo de sutura se coloca alrededorel conducto biliar y asegurado con un nudo quirúrgico. (C) A partir de entonces, una segunda sutura se coloca en estrecha proximidad a la primera sutura y anudado alrededor del conducto biliar. (D) La sutura se acorta, la cavidad se enjuagaron con solución de NaCl al 0,9% , y todos los órganos sustituidos a su posición fisiológica. Figura 5:.. Representación precisa de anudar Para documentar la colocación de las suturas y la fijación de los dos nudos que impiden el flujo de bilis, el mismo procedimiento que se describe en la Figura 4 se documentó en virtud de un binocular (A) Confinamiento del conducto biliar con el primera sutura. (B) Knotting de la primera sutura. (C) El confinamiento de la vía biliar con la segunda sutura. (D) Knotting de la segunda sutura. (E) doble ligó bilis dUCT después de acortar de exceso de suturas. (E ') Este panel muestra un boceto de (E). Las posiciones de la derecha (RL), Izquierda (ll) y la mediana (ml) lóbulos del hígado, así como el conducto biliar, el estómago y el duodeno se letras. En el boceto de la vía biliar se ligó doble por dos suturas. Figura 6:. Anatomía de la vía biliar, la vena porta y la arteria hepática en ratones Para una mejor localización anatómica del conducto biliar común, la vena porta y la arteria hepática se representan como un esquema. Marcado son también las posiciones de la derecha (rl), izquierda (ll) mediana (ml) y el caudado (CL) lóbulos del hígado. Figura 7: Aspecto Representantence de hígados 2 semanas después de la operación simulada y BDL. C57BL / 6 ratones fueron sometidos a operación simulada o cirugía BDL. Después de dos semanas se abrió la cavidad visceral. Mientras que los hígados de los animales con operación simulada no mostraron ninguna señal de fibrosis, los hígados de los animales que recibieron la ligadura del conducto biliar tenían una estructura de superficie irregular con formación de edema y nódulos fibróticos en la superficie de los hígados correspondientes. Figura 8:. Hematoxilina y eosina secciones de hígado se preparan a partir de ratones C57BL / 6 animales naturales que eran simulacro de accionamiento (A) o recibieron BDL durante tres semanas (B). Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina siguientes procedimientos estándar. Tenga en cuenta las alteraciones típicas en el hígado BDL que incluyen signos de inflamación (células infiltrantes), parénquima (hepatocyte) necrosis, y la proliferación de los conductos biliares. La barra de escala en cada panel cifra representa 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9: lecturas histológicos y bioquímicos de la fibrogénesis hepática. (A) secciones de hígado se prepararon a partir de animales que recibieron operación simulada o BDL durante 2 semanas y se tiñeron con rojo sirio (panel superior, las fibras de colágeno en rojo) o analizaron para la expresión de α-actina de músculo liso (α-SMA) (panel inferior , células positivas α-SMA en marrón) por inmunohistoquímica. La barra de escala en cada panel cifra representa 100 micras. (B) los extractos proteicos de hígados fueron sometidos a Western blot y se analiza para expresión de colágeno de tipo I, α-SMA, y vimentina que son marcadores de la fibrogénesis hepática bien establecida. La expresión de lipocalina-2 (LCN2) indica la respuesta inflamatoria que se asocia con la fibrogénesis en curso. En este análisis, la igualdad de carga de proteínas se demostró sondeando las manchas con un anticuerpo específico para β-actina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 10:. Tinción inmunológica de la infiltración de células inflamatorias secciones de hígado de serie se prepararon a partir de un hígado de un animal que recibió ligadura del conducto biliar durante 3 semanas. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina (A) o con un anticuerpo que es específico para CD45 (B). Tenga en cuenta,el elevado número de células positivas CD45 que rodean los conductos biliares. Estos infiltrados masivos que indican la inflamación no son visibles en las secciones de hígado derivados de animales con operación simulada (no mostrados). La barra de escala en cada panel cifra representa 500 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Lesión hepática colestásica es uno de los principales factores causales para el desarrollo de la fibrosis hepática y la cirrosis en pacientes con enfermedad hepática crónica. Con base en el hecho de que estas enfermedades producen costos de atención de la salud imponderables, es comprensible que muchos investigadores están tratando de comprender los mecanismos patogénicos de la fibrosis hepática en curso. Por lo tanto, se han generado modelos experimentales que imitan los diversos aspectos de los complejos mecanismos que conducen a la inflamación hepática, fibrosis y cirrosis ^1.

BDL quirúrgica es uno de los modelos experimentales más extendidas que se utiliza para inducir la lesión colestásica obstructiva en ratones y ratas ^4,23,24. En la mayoría de los protocolos, los animales son anestesiados y una laparotomía sección media se lleva a cabo. Posteriormente, el conducto biliar se descubre de la cavidad abdominal y se ligó dos veces utilizando hilo quirúrgico. Como consecuencia, los ratones y las ratas que recibieron esta cirugía desarrollar una reacción fibrótica fuerte que al principio se originan en los campos periportales ^25. Durante los años se han descrito varias técnicas y modificaciones quirúrgicas diferentes. Procedimientos especiales permiten incluso la reconexión o reanastomosis después BDL ^23. Otras técnicas se basan en BDL parcial resultante en significativamente menos formación de necrosis y consecuentemente la proliferación de hepatocitos ^24. BDL parcial en combinación con la posterior eliminación de la vesícula biliar (colecistectomía) que previene la formación de colecistitis también representa un modelo experimental excelente para colestasis aguda. Se propuso un modelo que está más cerca de la situación humana ^24. Y, de hecho, durante el establecimiento de este modelo, se ya se ha demostrado que causa reproducible colestasis con sólo el daño tisular mínima histológico y no se detiene a colestasis crónica ^25. Por lo tanto, se sugirió que este modelo es ideal para estudiar latefectos electrónicos de colestasis invertido ^24. Incluso los métodos más sofisticados se basan en microcirugía y permiten una manera rápida y reproducible para causar una lesión hepática colestásica sólo en partes seleccionadas del hígado ^26.

Aunque estas modificaciones sofisticadas del protocolo original BDL han demostrado ser muy útil en la investigación de temas específicos de investigación, muchos laboratorios en todo el mundo, básicamente apuntan a emplear el modelo BDL como modelo altamente reproducible y confiable para la fibrosis hepática colestásica. Sin embargo, muchas complicaciones pueden ocurrir que podría alterar sustancialmente la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados obtenidos con este modelo, si no se evitan las imprecisiones técnicas. Por ejemplo, sangrado complicaciones relacionadas con la lesión de los vasos sanguíneos que acompañan el conducto biliar (véanse las figuras 3 – 4) pueden ocurrir durante o rápidamente después de la cirugía. La sobredosis de anestesia con la subsiguiente cardiodepresión o rfracaso espiratorio son también complicaciones evitables del procedimiento. Las infecciones graves, que van desde peritonitis a la sepsis, pueden ocurrir durante todo el período del experimento, si las suturas no se realizan con precisión y fugas de bilis en la cavidad peritoneal. Las lesiones accidentales en el intestino durante la cirugía también podría dar lugar a una peritonitis. Por lo tanto, es obvio que los protocolos normalizados que están en conformidad con las directrices estrictas de manipulación están fuertemente requieren. Esta disposición también se exigió recientemente dentro de los países de la Unión Europea, que implementó nuevas normas de bienestar animal en 2013 ^1. Las respectivas normas que están asociados con esta regulación no son nuevas y ya fueron propuestas en 1959, cuando Russell y Burch sugirieron una ética marco para la realización de experimentos científicos con animales que se basan principalmente en una sustitución, mejora y reducción de (3R) Principio ^27.

Si se sigue la outlinprotocolo ed sólo hay unas pocas complicaciones que puedan derivarse de las inexactitudes técnicas. Tres temas específicos podrían ocurrir en lugar de baja frecuencia.

Como con todos los procedimientos quirúrgicos, la sobredosis de anestésico es una fuente potencial de peligro para los animales, especialmente en combinación con hipotermia. Si durante la cirugía se producen complicaciones cardiovasculares, el suministro de anestésicos debe interrumpirse inmediatamente y el operador debe tratar de proporcionar más posible de oxígeno al ratón. Esto se puede hacer por medio de una jeringa pequeña de plástico que se llena de aire y se bombea dentro de la boca del animal deteriorada. Alternativamente, el uso de un pequeño Peleusball para la ventilación del animal afectado, a menudo es útil para el proceso de revitalización.

Los problemas en la cicatrización de heridas

Después de la cirugía de BDL, los ratones pueden morder sus propias costuras doloridos o los de otros animales. Si esto ocurre, los ratones respectivos deben ser separadoenjaulado. Los animales con heridas abiertas deben ser anestesiados, la región alrededor de la herida esteriliza suavemente con un antiséptico estándar, y la herida debe ser cosido de nuevo. Durante los próximos 3 días, la herida de estos animales debe ser inspeccionado regularmente (dos a tres veces al día).

Distensiones del abdomen o la formación de ascitis son indicativos para las infecciones bacterianas. Estos pueden ocurrir debido a no estéril de trabajo durante la cirugía. Todo tipo de infecciones se debe manejar sin excepción como criterio de valoración humana y los animales afectados debe ser sacrificado.

Proporcionamos un fácil seguir el protocolo que permite la realización de BDL en ratones que es simple de implementar y evoca la mortalidad sólo bajo animales combinado con una alta reproducibilidad. Todos los protocolos quirúrgicos puede ser aprehendido rápidamente por científicos calificados. Durante la experimentación completa, los animales se mantienen en una placa de calentamiento a 37 ° C y permanentemente conectadosa un sistema de anestesia minimizar el dolor y la angustia. Para la cirugía, se abre el abdomen con una laparotomía media y el conducto biliar doble ligó sin disección. Los resultados representativos que se discutieron aquí demuestran que las alteraciones fenotípicas en lo que respecta a la morfología del hígado (inflamación, fibrosis, cirrosis) son altamente reproducibles y permiten estudiar diferentes aspectos de la fibrogénesis (ej., La iniciación, la inflamación, la progresión de la enfermedad en etapa terminal) en los puntos de tiempo definidos.

Esperamos que el resumen de nuestro protocolo ayudará a acortar la curva de aprendizaje que es necesario establecer con éxito este modelo de fibrosis en otros laboratorios y garantizar resultados confiables y reproducibles en diferentes lugares. De esta manera creemos que el protocolo presentado apoya el principio 3R que se suponía por Russell y Burch en 1959 y representa la base de las nuevas normas de bienestar animal que se aplican actualmente en muchos países widelgada del Marco Europeo.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer el apoyo financiero de la Fundación Alemana para la Investigación (SFB / TRR57, Q3 y Q2). Los autores agradecen a Mareike Schulz, Pascal Paschenda y Klaudia Warzecha por su ayuda en la preparación de las fotografías.

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Shaver Favorita II	Aeskulap	GT104
Cutter head	Aeskulap	GT730
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Warming plate and controller	Labotect	HP 062
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Scotch Tape	commercially available
Tissue paper	commercially available
Durapore silk tape	3M	1538-1
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes	Lohmann & Rauscher GmbH	33013
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Graefe forceps straight	Fine Science Tools Inc.	11050-10
6-0 Mersilk suture	Ethicon	K889H	Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Colibri retractor	Fine Science Tools Inc.	17000-03
Cotton swabs	Noba Verbandmittel	974202
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1032238
25mL beaker	Schott Duran	50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31	Fine Science Tools Inc.	11370-31	Bile duct separation
5-0 Mersilene suture	Ethicon	EH6731H	Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe	BD Discardit II	300296
1mL syringe	BD Plastipak	300013
Sterican needle 26 G x 1	B. Braun	4657683
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp	Petra Electric	IR 11

Referanslar

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Bile Duct Ligation Mice Cholestasis Liver Injury Liver Fibrosis Obstructive Cholestasis Bile Flow Obstruction Surgical Technique Animal Model

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Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Weiskirchen, S., Borkham-Kamphorst, E., Tolba, R. H., Tacke, F., Weiskirchen, R. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J. Vis. Exp. (96), e52438, doi:10.3791/52438 (2015).