Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Carmen G. Tag; Sibille Sauer-Lehnen; Sabine Weiskirchen; Erawan Borkham-Kamphorst; Ren&#233; H. Tolba; Frank Tacke; Ralf Weiskirchen

doi:10.3791/52438

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

מרה Duct קשירת בעכברים: אינדוקציה של דלקת כבד פגיעה ופיברוזיס ידי חסימתית cholestasis

Published: February 10, 2015

doi:

10.3791/52438

Carmen G. Tag¹, Sibille Sauer-Lehnen¹, Sabine Weiskirchen¹, Erawan Borkham-Kamphorst¹, René H. Tolba², Frank Tacke³, Ralf Weiskirchen¹

¹Institute of Molecular Pathobiochemistry, Experimental Gene Therapy and Clinical Chemistry,RWTH Aachen University, ²Institute for Laboratory Animal Science and Experimental Surgery,RWTH Aachen University, ³Department of Medicine III,RWTH Aachen University

Özet

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Abstract

ברוב בעלי החוליות, הכבד מייצר מרה כי יש צורך חלב שומנים נספגים ולאפשר העיכול של שומנים במעי הדק וכן להפריש מוצרים מטבולים אחרים בילירובין ו. בכבד, החסימה הניסיונית של מערכת המרה extrahepatic יוזם מפל מורכב של אירועים פתולוגיים שמוביל לcholestasis ודלקת וכתוצאה מכך תגובת fibrotic חזקה שמקורם בשדות periportal. לכן, קשירה כירורגית של צינור המרה המשותפת הפכה את המודל הנפוץ ביותר כדי לגרום לפציעת cholestatic חסימתית במכרסמים וללמוד את האירועים המולקולריים ותאיים שבבסיס מנגנוני pathophysiological אלה הנגרמים על ידי זרימת מרה בלתי הולמת. בשנים האחרונות, טכניקות ניתוחיות שונות תוארו שגם תאפשר חיבור מחדש או reanastomosis לאחר קשירת צינור המרה (בד"ל), למשל, בד"ל חלקי, או בשיטות אחרות למייקרו שאלות מחקר ספציפיות. עם זאת, המודל נפוץ ביותר בשימוש הוא החסימה של צינור המרה המשותף שגורם תגובת fibrotic חזקה לאחר 21 עד 28 ימים המלאה. שיעור התמותה יכול להיות גבוה עקב סיבוכים מדבקים או אי-דיוקים טכניים. כאן אנו מספקים ניתוח מפורט למודל בד"ל בעכברים שמביאים לתגובה fibrotic מאוד לשחזור בהתאם לשלטון 3R לרווחת בעלי החיים הניחה על ידי ראסל וורץ בשנת 1959.

Introduction

הפיברוזיס מוגדר כייצור מוגזם וההצטברות של תאי מטריקס (ECM) שמקורה ברשת מסועפת של יחסי גומלין של תאי stellate כבד לייצור מטריקס ועוד מגוון רחב של תאי דם בכבד-התושב ותאים שחדרו ^1,2. למרות סיסטיק כבד יכול להיגרם על ידי מספר רב של גירויים שונים המנגנונים המולקולריים שבבסיס סיסטיק הם בדרך כלל דומים מאוד. בעקבות נזק כבד, תכנית מתוזמרת מאוד של שינויים מולקולריים ותאיים היא יזמה. בתכנית זו אינטראקציה הדוקה בין אותות, מונוציטים / מקרופאגים דלקתיים ותאי stellate כבד מתרחשת כי בסופו של דבר התוצאות בהפעלת stellate תא וtransdifferentiation לmyofibroblasts, בתצהיר ECM ושינויים אנטומיים ותפקודיים רצופים של שלמות רקמת כבד ^3. הפעלת תאי stellate הכבד היא מונעת בעיקר על ידי אותות דלקתיים ואינטראקציות עם כבדמקרופאגים מגורים (כלומר תאי Kupffer). דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן מוכרים על ידי קולטנים זיהוי תבניות מיוחדים כגון קולטנים כמו אגרה שכאשר מופעל אות באמצעות רשת מורכבת של מסלולים שונים המפעילים את הביטוי וההפרשה של מספר רב של ציטוקינים דלקתיים וכמוקינים המניעים את התהליך הדלקתי ^3. התגובה הדלקתית והעלבון הכבד נוצר הוא זמנית בלבד, כאשר גורם ייצור המחלה מוסר. לעומת זאת, אם הפגיעה נמשכת, דלקת כרונית מתפתחת בתוך הכבד והביטוי וההצטברות של המוני ECM בחזית וכתוצאה מכך התחלופה הדרגתית של parenchyma כבד הנורמלי על ידי יצירת רקמת צלקת.

מאז fibrogenesis כבד בבני האדם היא בעיה קלינית ברחבי העולם, כמה מודלים של מכרסמים ניסיוניים של אי ספיקת כבד אקוטית וכרונית הוקמו בעשורים האחרונים. בmuמערכת rine למשל, דגמים נפוצים הם הממשל של מגוון רחב של hepatotoxins שונה, קשירה של צינור המרה המשותף, אינדוקציה של פגיעה בכבד בתיווך חיסונית, והמבוא הממוקד של פגמים גנטיים או להיפך ביטוי היתר של transgenes המשפיעים קריטי מסלולי איתות מעורבים בפתוגנזה של הפיברוזיס ^4.

קשירה של צינור המרה המשותף במכרסמים בוצעה כהליך ניסיוני במחקר במשך שנים רבות ^5-8. פרוטוקול מאוד לשחזור ראשון לקשירת מרה ממושכת צינור (בד"ל) במכרסמים כבר הציג החברה לפני יותר משלושה עשורים ^9. בפרוטוקול זה הן cannulation / חסימה וקשירה מושרה תשואה גבוהה של חמת בחולדות עם שינויים מורפולוגיים שהיו דומים לאלו שנצפו שבחמת מרה אדם ^9. הפרוטוקול המתאים הוא פשוט, ההליך הכירורגי הוא יחסית במהירות ישים, ושיעורי ההישרדות של בעלי החיים גבוהים עם מעל 95%. בפרוטוקול cannulation / חסימת עכברוש הקלאסי, חתך קצר של 2 סנטימטר נעשה ממש מתחת לתהליך xiphoid. לאחר מכן, צינורית מוחדרת לתוך החלק הפרוקסימלי של צינור המרה וקבועה בעמדתה עם תפרי משי. בשלב הבא, החלק הדיסטלי של הצינורית חסום עם 3 קשרים, לשים עד לסוף התחתון של חתך קו האמצע ונקבר מתחת לעור ברביע הימני תחתון ^9. בסוף, הבטן סגורה ובעלי חיים מותר להתאושש. בפרוטוקול קשירה, חולדות נתונים לקשירה כפולה של צינור המרה המשותף עם או בלי דיסקציה של צינור המרה בין חיבורי האותיות ^9.

מודל ניסיוני זו מקובל גם ושימוש ברחבי העולם במאות מעבדות לגרום cholestasis הכבד וסיסטיק. זה גורם התפשטות תאי אפיתל intrahepatic מרה, differentiatio myofibroblasticn של fibroblasts פורטל סביב מתרבים תאי האפיתל של דרך מרה, וכתוצאה מכך ביטוי לשחזור מאוד, מאסיבי ותצהיר של ECM ^10,11. לכן, היישום של מודל זה בחולדות ועכברים הוא להיות פופולרי בקרב מדענים שמטרתם להבין את הפתוגנזה של דלקת ופיברוזיס בכבד.

במעבדה שלנו, יש לנו בשימוש נרחב בפרוטוקול זה בעבר בחולדות בכמה מחקרי ניסויים במטרה לחקור היבטים מולקולריים ותאיים מיוחדים של fibrogenesis הכבד ולבחון מושגי antifibrotic רומן ותרופות ^12-15.

לאחרונה, אנו מותאמים מתודולוגיה זו למערכת העכברית ומצאנו כי ניתוח קשירת צינור המרה הוא גם מתכוון אטרקטיבי להקמת סיסטיק תלוי זמן עם וריאציה נמוכה ותמותה בעכברים ^16-18. בשל גודלו הקטן יותר של בעלי החיים, לעומת זאת, כמה שינויים חשובים בכל קשור להרדמה, interv כירורגיתention ותצפית שלאחר הטיפול הם הכרחיים כדי להשיג תוצאות אמינות ושחזור במודל זה. ההסתגלות המלאה מסוכמת בפרוטוקול הבא ובתיעוד וידאו המצורף.

Protocol

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים מדינה ושימוש הרשמית (LANUV, רקלינגהאוזן, גרמניה). העכברים הם שוכנו בתנאים מסוימים-הפתוגן ללא בהתאם להנחיות של הפדרציה למעבדת עמותות מדע בעלי חיים (FELASA). כל הניסויים נערכו בהתאם לחוק הפדרלי הגרמני הנוגע להגנה על בעלי החיים ו'המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה '(המכון הלאומי לפרסום 8 Edition ה הבריאות, 2011). 1. הכנת Presurgical הערה: בצע את כל הנהלים בתנאים נקיים, אבל לא סטרילי. כל המכשירים והציוד לשימוש חוזר אחר כגון מלקחיים כירורגיים, מספריים, ומפשק Colibri שמשמשים לביצוע ניתוח חייבים להיות מעוקרים לפני שימוש על פי פרוטוקולים שנמצאים בהקפדה על ההנחיות מוסדיות לביצוע ניתוחים בבעלי חיים.; לקבלת רשימה מפורטת של חומרים כימיים, חומרים וציוד דרושים, עיינו ברשימה של חומרים / ציוד ספציפי. במהלך הניסויים מלאים, לשמור על בעלי החיים על צלחת התחממות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באופן קבוע המחוברת למערכת הרדמה, וכיסוי השטח התפעולי הכולל עם, וילונות מודבקים עצמם נוזל-חדיר. כראוי לארגן את כל כלי מדידה ופתרונות המשמשים בניסויים לפני הניתוח (איור 1). להרדים את העכבר עם שאיפה של isoflurane% 4 כרך ב 100% חמצן בקצב זרימה של 4 L / min לאינדוקציה של ההרדמה. עומק הרדמה הוא מספיק בעת הקריטריונים החיוניים הבאים הגיעו: נשימה רגילה ספונטנית, לא רפלקס לאחר ההגדרה של גירויי כאב בין אצבעות רגליים, ולא כתגובה לכאב. לגלח את הפרווה הבטן של העכבר עם מכונת גילוח חשמלי פרווה ולהגן על העיניים מהתייבשות על ידי שימוש בעין וnהמשחה OSE. הנח את העכבר על צלחת חמה מחוממת 37 מעלות צלזיוס, להכניס את חוטם העכבר במסכת Fluovac של מערכת ההרדמה Fluovac, ולתקן את הרגליים של בעלי החיים עם פסים של סרט משי. לשמור על ההרדמה של העכבר על ידי שאיפה של isoflurane% 1.5-3 כרך ב 100% חמצן בקצב זרימה של L / min 1 ולגייס את שיכוך כאבים סביב ניתוח באמצעות זריקת intraperitoneal של פתרון עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם BW מומס בשיעור של 0.9% פתרון NaCl) . לעקר את עור הבטן המגולח עם ספוגית גזה שטבולה בתקן חיטוי, מוכן לשימוש פתרון אלכוהוליים לטיפול טרום ניתוחי של העור. הערה: בפרוטוקולים שלנו אנו משתמשים antisepticum עור פולי-אלכוהול. זאת בהתאם מלא עם החוק הפדרלי הגרמני הנוגע להגנה על בעלי חיים וההנחיות של הפדרציה למעבדת עמותות מדע בעלי חיים. חיטוי זה מכיל 70% (v / v) 2-propanol, butan-1,3.diol ועקבות של quinoline צהובות, וperfumדואר. 2. ניתוחים פתח את הבטן עם laparotomy קו האמצע של אורך של כ 2 סנטימטר על ידי חיתוך cutis תוספת fascia באותו הזמן עם מספריים כירורגיות 11.5 סנטימטר. לנתח את רקמת החיבור בחלקו העליון של הצפק באמצעות המספריים כמפזר. חותך את הצפק לאורך linea alba כדי לפתוח את חלל הצפק. הגדלת החלל על ידי החדרת תפר החזקה בחזה, העלאת נימה של התפר, ולתקן אותו על גבי מסכת Fluovac. מורחים את אזור הפעולה על ידי החדרת מפשק Colibri בחלל הצפק (איור 2). הרם את הכבד עם (0.9% פתרון NaCl) מקלון צמר גפן לחות כך שצד הגחון שלו נדבק לסרעפת וhilum נראה בבירור. לחשוף את צינור המרה על ידי תנועת הזנב של הבטן (איור 3). להפריד בזהירות את צינור מרה מאיגוף וריד שער ועורק כבד באמצעות מלקחיים מיקרו-serrations (איור 4 א). הנח את 5-0 התפר סביב צינור המרה ולאבטח אותו עם שני קשרים כירורגית. כאשר קשירת הקשרים להגדיל את כוח המשיכה ברציפות כדי להבטיח חסימה אפקטיבית מבלי לנתק את צינור המרה (איור 4). הוסף קשירת גולגולת שנייה באותו אופן, אבל לא לנתח את צינור המרה בין (איור 4C). אחרת קיים סיכון ניכר שהדלפות מרה אם קשר אחד אינו מאובטח, ובעלי החיים שלא לחוות כל cholestasis אבל לפתח דלקת הצפק חמורה. חותך את הקצוות של התפרים (איור 4D), להוריד את עצם החזה, והסר את מפשק. יש לשטוף את חלל הצפק עם 0.9% פתרון NaCl ולהחליף את אברי בטן לעמדות הפיזיולוגיות. שכבות לסגור שתי בטן (צפק וcutis תוספת facia) עם תפרי ריצה נפרדים עם 6-0 Mersilk. חותך את הדוארnds של התפרים ולחטא את אזור הפעולה עם ספוגית גזה טבולה בתמיסת חיטוי. הערה: בעת ביצוע הניתוח בפעם הראשונה, לבצע את כל ההליכים תחת מיקרוסקופ ניתוחי בהגדלה של 16X-20X. זה מאפשר הכרה טובה יותר של צינור המרה וברור שמבדיל אותו מוריד השער והעורק כבד (איורים 5, 6). מעבדות מסוימות ממליצה לנתיחה בצינור המרה בין שני חיבורי האותיות. השאר את צינור המרה שלמה בגלל דליפות פוטנציאליות באחד הקשרים יגרמו לדלקת הצפק חמורה חריפה, מיימת, וendotoxemia המערכתי כאשר צינור המרה הוא גזור. 3. לאחר ניתוח טיפול ומעקב אפשר העכבר כדי לשחזר בכלוב התחמם על ידי מנורת אינפרא אדום עד העכבר הוא ער ופעיל באופן מלא. לאחר מכן, להזיז את העכבר לכלוב נורמלי וגישה כרצונך מודעת מים ומזון לספק. חרה הניתוח, לעקוב אחר בעלי החיים במרווחים זמן קבועים ולבצע טיפול לאחר ניתוח מעקב עם שיכוך כאבים מתאימים (לדוגמא, פתרון עצירות) בעקבות ההמלצה המקומית של הטיפול בבעלי החיים הפנימי ולהשתמש בועדות. הערה: בצע טיפול במשככי כאבים במשך 3 ימים. כל התנהגות חריגה עשויה להצביע על סיבוכים נדירים כגון דלקת הצפק, אלח דם או דימום פנימי וצריכה להיות מטופלים כנקודת קצה אנושי כדי לסיים את הניסוי. בעלי חיים נשמרים עם גישה חופשית למזון ומים כרצונך עד סוף הניסוי. אין צורך ברישום דם מאז fibrogenesis המתמשך הוא הצביע על ידי צהבת. כאשר בעלי חיים מוקרבים, דם נאסף למדידת פרמטרים קליניים כימיה (AST, ALT, בילירובין וכו ') והכבד מאוחזר לניתוח histochemical וביוכימיים.

Representative Results

בניסויים טיפוסיים בד"ל בוצע בעכברי C57BL / 6 wild-type 40 גברים שקלול על 18-20 גרם. ניסוי זה נעשה על מנת לחקור fibrogenesis כבד בשלב הייזום (3 ו -7 ימים), במהלך התקדמות (10, 14, ו -20 ימים), ובמהלך ארוך הטווח (30 ו -60 ימים) 16. במודל זה, סיסטיק persinusoidal פיתח כבר ביום 10 אחרי הניתוח, בעוד סיסטיק periportal שאופן קבוע עלה עד סוף הניסוי פותח במלואו לאחר 20 ימים. בניסוי שהוזכר, כל החיות שקיבלו דמה פעולה פשוטה שרדו, ורק שתיים מתוך 40 העכברים (5%) שקיבלו בד"ל פיתחו מצב כללי ירוד ולפיכך הקריבו בטרם עת לפני נקודת הסיום המתוכננת של הניסוי. הפעילות של בעלי חיים דמה המופעל הייתה ללא יוצא מן הכלל כבר יום אחד נורמלי לאחר laparotomy, בעוד שרוב בעלי החיים נתון לבד"ל הראה פעילות מופחתת בשלושת הימים הראשונים. Jעור aundiced היה ברור כבר בכל בעלי החיים בד"ל יום או יומיים לאחר ההגדרה של בד"ל 16. הערכים של שני aminotransferase אלאנין (ALT) וטרנסאמינזות aspartate (AST) שמייצגים סמני סרום מבוססים היטב של פגיעה בכבד במהירות מוגברת והגיעו לשיאו במהלך היום 7 ויום 20 לאחר בד"ל (טבלה 1). לאחר מכן, ALT ו- AST התמתנו עד יום 30 ונשארו יציב עד 60 ימים לאחר הניתוח. בקנה אחד עם פגיעת cholestatic, ריכוזים בסרום של בילירובין הכולל היו גבוהים בעקביות והגיעו לרמה לאחר 7 ימים 16. כמובן זמן דומה של פעילות ALT וסרום AST דווחו גם לחולדות שעברו BDL. במחקר שנערך לאחרונה זה היה הוכחה כי רמות AST בסרום וALT המוגבר עד 5 או פי 10 מרגילים בשבוע הראשון לאחר ניתוח בד"ל וירד לאחר שבועיים 19. בדרך כלל, את הכבדים של בעלי חיים דמה המופעל עדיין נראים סמוטh בסוף הניסוי, ואילו את הכבדים של בעלי חיים שקיבלו בד"ל להראות שינויים אדריכליים שבעיקר מאופיינים בהיווצרות של גושי בצקת וfibrotic על פני השטח של מקביל כבדים וhydrops של כיס המרה כי הוא מלא בכמויות גדולות של מרה (איור 7). השינויים מורפולוגיים האופייניים של הכבד הנגרמים על ידי ניתוח בד"ל גם להדגמה בניתוח סטנדרטי היסטולוגית (איור 8). באותו הסט של ניסויים, פיתוח של פיברוזיס בכבד היה חצי כמותית מוערכת בהתבסס על היסטולוגיה הכבד הוערכה על ידי פתולוג סנוור באמצעות שיטת ניקוד שבסיסטיק periportal היה מבוים 0-4 וסיסטיק perisinusoidal 0-2, נותן מקסימום ערך שהיה שווה ערך לשחמת 6. כצפוי, הציון הממוצע בסיסטיק הקבוצה של בעלי חיים דמה המופעל היה 0.00 ± 0.00. בניגוד לכך, בקבוצה של בעלי חיים לאכובע קיבל בד"ל, הציון עלה בהתמדה עד יום 60 לשווי של 4.83 ± 0.17. מקסימום 3 לסיסטיק periportal הושג ביום 20. בכל בעלי החיים ניתחו, סיסטיק perisinusoidal נעדר במהלך 10 הימים הראשונים של הניסוי והיה ראשית מורגש לאחר שבועיים. לאחר מכן, הוא גדל בהתמדה עד סוף הניסוי לערכים של 1.8 ± 0.17 (טבלה 1). גם במספר ניסויים בבעלי חיים עצמאיים אחרים שבוצעו, זה היה ציין כי ההיווצרות של סיסטיק הייתה עלייה מאוד לשחזור מראה תלוי זמן של ביטוי קולגן intrahepatic ותצהיר כתוצאה מfibrogenesis המתמשך (איור 9). בדומה לכך, התהליך של fibrogenesis המתמשך בולט בביטוי גבוה של אקטין שריר α-חלק (α-SMA) שמייצג את סמן של תאי fibroblastic, מופעל בכבד תאי stellate וmyofibroblasts פורטל כלומר, וhydroxyproline הכבד, חומצת אמינו נמצאה בשפע בקולגן מטריצות 18 (איור 9). בנוסף, הביטוי של vimentin שמציין הגדלת כמויות של myofibroblasts או fibroblasts הוא גדל לאחר ההגדרה של ניתוח בד"ל 20. Concomitance של דלקת בכבד נפגע משתקף עוד יותר על ידי ביטוי מוגבר של Lipocalin 2 (LCN2), כי הוא מאוד מושרה במהלך פגיעה בכבד אקוטית וכרונית ומתפתחים תופעות hepato-מגן במהלך פגיעה בכבד חריפה 21,22. תאים דלקתיים הלחדור את הכבדים של בעלי חיים שקיבלו בד"ל יכולים להיות מזוהים על ידי צביעה ספציפית עם נוגדן שהוא ספציפי לCD45 (איור 10). סמן משטח זה סלולארי שידוע גם בשם PTPRC (phosphatase חלבון טירוזין, סוג קולטן) בא לידי ביטוי במיוחד בכל תאי hematopoietic המובחנים מלבד אריתרוציטים ותאי פלזמה. <table fo:keep-together.within-page = "תמיד" > זמן מה לאחר קשירת צינור המרה (ימים) בילירובין סה"כ AST (U / L) ALT (U / L) סיסטיק הפורטל סיסטיק Perisinusoidal ציון כולל (מ"ג / ד"ל) 0 (n = 3) 0.17 ± 0.06 192.67 ± 30.50 50.33 ± 6.03 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 3 (n = 5) 6.85 ± 2.21 1,159.25 ± 319.27 566.50 335.25 ± 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 7 (n = 5) <td> 14.38 ± 2.14 ± 976.60 477.16 ± 448.20 259.47 ± 0.60 ± 0.25 0.0 ± 0.0 0.60 ± 0.25 10 (n = 5) 15.92 ± 2.60 1,916.60 ± 868.25 560.40 ± 80.88 1.40 ± 0.25 0.25 ± 0.25 1.67 ± 0.25 14 (n = 5) 17.90 ± 3.84 1,088.60 ± 276.32 505.00 ± 96.15 ± 2.4 ± 0.25 1.0 ± 0.0 3.40 ± 0.24 20 (n = 4) 18.00 ± 2.12 1,072.67 ± 364.27 404.00 195.48 ± 3.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 4.0 ± 0.0 30 (n = 5) 16.04 ± 4.79 446.40 169.75 ± 260.20 126.97 ± 2.8 ±; 0.2 1.4 ± 0.25 4.20 ± 0.20 60 (n = 6) 16.02 ± 1.19 484.67 117.79 ± 257.17 ± 50.97 3.0 ± 0.0 1.8 ± 0.17 4.83 ± 0.17 קיצורים הם: ALT, aminotransferase אלאנין; AST, aminotransferase aspartate. טבלת 1: פיברוזיס הבקיע בניסוי נציג נתונים של טבלה זו הועתקו ממחקר שבו הפיברוזיס היה מושרה על ידי קשירת צינור מרה בC57BL / 6 עכברים 16.. במחקר זה, שיעור התמותה לאחר ניתוח בד"ל היה 5% (2 מתוך 40 בעלי החיים בטרם עת הקריבו בגלל תנאים ירודים בבעלי החיים מפותחים). איור 1: התקנה ניסיונית לביצוע מרהצינור קשירה. החיה נשמר על צלחת התחממות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והאזור התפעולי מכוסה כולל עם, וילונות מודבקים עצמם נוזל-חדיר. במהלך הניתוח המלא, בעלי החיים מחוברים באופן קבוע למערכת הרדמה. כל כלי מדידה ופתרונות (משככי כאבים, ההרדמה, תמיסת חיטוי, 0.9% NaCl) מסודרת בצורה ברורה. איור 2:. הכנת אזור ניתוח פתיחה מוקדמת של חלל הצפק, עור הבטן צריך להיות מגולח עם מכונת גילוח חשמלי פרווה ולחטא עם ספוגית גזה חיטוי. אזור הניתוח ולאחר מכן מכוסה, וילונות מודבקים עצמם נוזל-חדיר. הבטן נפתחה עם laparotomy קו האמצע (~ 2 סנטימטר אורך). החלל מוגדל על ידי החדרת תפר מחזיק בחזה ובאזור הפעולה מופץ על ידיהחדרת מפשק Colibri מאפשר ניסויים ללא הפרעה במהלך הניתוח. איור 3: חשיפה של צינור המרה. (א) לביצוע קשירת צינור מרה, בצד הגחוני של הכבד הרים כך שהוא יכול להיצמד לסרעפת וhilus הכבד הופך גלוי לעין. (ב) כדי לחשוף את צינור המרה טוב יותר, הבטן מועברת caudally עם מקלון צמר גפן humidified. צינור המרה מסומן בחץ. איור 4: ligating צינור המרה. (א) בשלב ראשון, את צינור המרה מופרד בזהירות מאיגוף וריד שער ועורק כבד באמצעות מלקחיים מיקרו-מַסוֹרִיוּת. (ב) בהמשך לכך, תפר ממוקם סביבצינור המרה ומאובטח עם קשר כירורגית. (ג) מכאן ואילך, תפר שני ממוקם בסמיכות לתפר הראשון וקשור סביב צינור המרה. (ד) התפר מתקצר, החלל שטף עם 0.9% פתרון NaCl , וכל האיברים הוחלפו לעמדה הפיזיולוגית שלהם. איור 5:.. ייצוג מדויק של קשירה כדי לתעד את המיקום של התפרים ואת ההגדרה של שני קשרים המונעים זרימת מרה, אותו ההליך המתואר באיור 4 תועד תחת משקפת () מאסר של צינור המרה עם תפר ראשון. קשירה (B) של התפר הראשון. (ג) מאסר של צינור המרה עם התפר השני. (ד) קשירה של התפר השני. (E) פעמיים ligated ד מרהuct לאחר קיצור של תפרים עודפים. (E ') פנל מתאר סקיצה של (E). עמדותיה של הזכות (RL), שמאלה (LL) ואונות חציון (מיליליטר) של הכבד, כמו גם את צינור מרה, קיבה, ותריסריון הם אותיות. בסקיצת צינור המרה הוא ligated כפול על ידי שני תפרים. איור 6:. אנטומיה של צינור מרה, וריד שער ועורק כבד בעכברים למיקום האנטומי טוב יותר של צינור המרה המשותף, וריד שער ועורק כבד מתוארים כערכה. סימנו גם את עמדותיה של הזכות (RL), חציון שמאלה (ll) (מיליליטר) וcaudate אונות (CL) של הכבד. איור 7: appeara נציגפליטות של כבדים 2 שבועות לאחר ניתוח הדמה וBDL. C57BL / 6 עכברים היו נתונים לדמה פעולה או ניתוח BDL. אחרי השבועיים חלל הבטן נפתח. בעוד את הכבדים של בעלי חיים דמה המופעל לא הראו שום סימן של סיסטיק, הכבדים של בעלי חיים שקיבלו קשירה של צינור המרה היה מבנה פני השטח לא סדיר עם היווצרות של בצקת וגושי fibrotic על פני השטח של כבדים מקבילים. איור 8:. סעיפים כבד Hematoxylin ו eosin כתם הוכנו מC57BL / 6 בעלי חיים מסוג בר שהיו דמה המופעל () או קיבלו בד"ל במשך שלושה שבועות (ב '). הקטעים היו מוכתמים בנהלים סטנדרטיים hematoxylin ו eosin הבא. נא לשים לב לשינויים האופייניים בכבד בד"ל הכוללים סימנים של דלקת (תאים שחדרו), parenchymal (hepatocyte) נמק, והתפשטות של צינורות מרה. סרגל קנה המידה בכל פנל דמות מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 9: readouts היסטולוגית וביוכימיים לfibrogenesis כבד. סעיפים כבד () הוכנו מבעלי החיים שקיבלו מבצע זיוף או בד"ל עבור 2 שבועות ומוכתמים עם סיריוס אדום (פנל עליון, סיבי הקולגן באדום) או ניתחו לביטוי של α-חלק אקטין שרירים (α-SMA) (פנל תחתון , תאים α-SMA חיוביים בחום) על ידי אימונוהיסטוכימיה. סרגל קנה המידה בכל פנל דמות מייצג 100 מיקרומטר. (B) תמציות חלבון מכבדים היו נתונים לכתם מערבי ונותחו לexpression שלי קולגן סוג, α-SMA, וvimentin שמבוססים היטב סמנים של fibrogenesis הכבד. הביטוי של Lipocalin-2 (LCN2) מציין את התגובה הדלקתית הקשור לfibrogenesis המתמשך. בניתוח זה, טעינת חלבון שווה הודגמה על ידי חיטוט הכתמים עם נוגדן ספציפי לβ-אקטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 10:. מכתים חיסונית של חדירת תאים דלקתיים סעיפים כבד סידוריים הוכנו מכבד של בעלי חיים שקיבלו קשירת צינור מרה במשך 3 שבועות. החלקים הוכתמו hematoxylin ו eosin (א) או עם נוגדן שהוא ספציפי לCD45 (ב '). לתשומת לבך,המספר הגבוה של תאים חיוביים CD45 המקיפים את צינורות המרה. מחלחל המסיבי אלה שמצביעים על דלקת אינו גלוי בסעיפים כבד מקורם בבעלי חי דמה המופעל (לא מוצג). סרגל קנה המידה בכל פנל דמות מייצג 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פגיעה בכבד cholestatic היא אחד הגורמים העיקריים סיבתי לפיתוח הפיברוזיס ושחמת כבד בחולים עם מחלת כבד כרונית. בהתבסס על העובדה כי מחלות אלה מייצרות עלויות טיפול רפואי שאין לשער, זה מובן שחוקרים רבים מנסים להבין את המנגנונים פתוגניים של סיסטיק הכבד המתמשך. לכן, מודלים ניסיוניים כבר נוצרו המחקים היבטים שונים של המנגנונים המורכבים שיובילו לדלקת בכבד, סיסטיק ושחמת כבד ^1.

בד"ל כירורגי הוא אחד הדגמים הניסיוניים הנפוצים ביותר המשמש ללגרום לפציעה cholestatic חסימתית בעכברים וחולדות ^4,23,24. ברוב הפרוטוקולים, בעלי חיים מורדמים וlaparotomy בטן מבוצע. בהמשך לכך, בצינור המרה הוא חשף מחלל הבטן וligated פעמיים באמצעות חוט כירורגי. כתוצאה מכך, העכברים וחולדות שקיבלו ד הניתוח הזהevelop תגובת fibrotic חזקה שבהתחלה מקורן שדות periportal ^25. במהלך השנים כמה טכניקות ניתוחיות שונות ושינויים שתוארו. נהלים מיוחדים אפילו לאפשר חיבור מחדש או reanastomosis לאחר בד"ל ^23. טכניקות אחרות מבוססות על בד"ל חלקי וכתוצאה מכך פחות משמעותי היווצרות נמק וכתוצאה מכך התפשטות hepatocyte ^24. בד"ל חלקי בשילוב עם ההסרה הבאה של כיס המרה (כריתת כיס המרה) שמונע היווצרות של דלקת כיס מרה גם מייצג מודל ניסיון מצוין לcholestasis החריף. הוצע להיות דוגמנית כי הוא קרוב יותר למצב האנושי ^24. ואכן, במהלך ההקמה של מודל זה, הוא כבר הוכיח שהוא reproducibly גורם cholestasis רק עם פגיעה ברקמות היסטולוגית מינימליות ולא ימשיך cholestasis הכרוני ^25. לכן, הוצע כי מודל זה הוא אידיאלי ללימוד latהשפעות דואר של cholestasis ההפוך ^24. אפילו בשיטות מתוחכמות יותר המבוססות על המייקר ולאפשר דרך מהירה ושחזור לגרום פגיעה בכבד cholestatic רק בחלקים נבחרים של הכבד ^26.

למרות שינויים אלה מתוחכמים מפרוטוקול בד"ל המקורי הוכחו מועילים מאוד בחקירת שאלות מחקר ספציפיות, מעבדות רבות בעולם בעצם מכוונים להעסקת מודל בד"ל כמודל לשחזור ואמין ביותר להפיברוזיס cholestatic. עם זאת, סיבוכים רבים יכולים להתרחש באופן משמעותי שיכולים לשנות את שחזור ואמינה של התוצאות שהושגו על ידי מודל זה, אם אי-דיוקים טכניים לא נמנעו. לדוגמא, דימום סיבוכים הקשורים לפציעתם של כלי הדם המלווים את צינור המרה (ראה איורים 3-4) עלולים להתרחש במהלך או במהירות לאחר ניתוח. מנת יתר של הרדמה עם cardiodepression או r הבאיםכישלון espiratory גם סיבוכים מיותרים של ההליך. זיהומים חמורים, הנעים בין דלקת הצפק לאלח דם, עלולים להתרחש במהלך תקופת הניסוי כולו, אם התפרים אינם מבוצעים באופן מדויק והדלפות מרה לתוך חלל הצפק. פציעות למעי במהלך הניתוח יכולות גם להוביל לדלקת הצפק. לכן, ברור שהפרוטוקולים סטנדרטיים העומדים בהנחיות טיפול קפדניים מאוד נדרשים. תניה זו גם דרשה לאחרונה במדינות האיחוד האירופי, אשר יישם כללי רווחת בעלי החיים חדשים בשנת 2013 ^1. הדרישות המתאימות הקשורים לתקנה זו אינן חדשות וכבר הציעו בשנת 1959, כאשר ראסל וורץ הציעו אתי מסגרת לביצוע ניסויים מדעיים עם בעלי חיים שמבוססים בעיקר על החלפה, עידון ועיקרון ההפחתה (3R) ^27.

כאשר בעקבות outlinפרוטוקול ed יש רק כמה סיבוכים שיכולים לנבוע מאי דיוקים טכניים. שלושה נושאים ספציפיים עלולים להתרחש בתדירות נמוכה למדי.

כמו בכל ההליכים כירורגיים, מנת יתר של חומר הרדמה הוא מקור פוטנציאלי של סכנה לבעלי החיים ובמיוחד בשילוב עם היפותרמיה. אם במהלך ניתוח סיבוכי לב וכלי דם להתרחש, האספקה של חומרי הרדמה יש להפסיק מייד והמפעיל צריך לנסות לספק כמה שיותר חמצן אפשרי לעכבר. ניתן לעשות זאת באמצעות מזרק פלסטיק קטן שמתמלא באוויר ונשאב לתוך פיו של בעל החיים לקויים. לחלופין, השימוש בPeleusball קטן לאוורור של בעלי החיים המושפעים הוא לעתים קרובות מועיל לתהליך ההתחדשות.

בעיות בריפוי פצע

לאחר ניתוח בד"ל, עכברים עלולים לנשוך תפרים שלהם כואבים או אלה של בעלי חיים אחרים. במקרה זה, עכברים המתאימים צריכים להיות בנפרדבכלוב. בעלי חיים עם פצעים פתוחים צריכים להיות מורדמים, האזור סביב הפצע מעוקר בעדינות עם סטנדרטי חיטוי, והפצע צריך להיות תפור שוב. במהלך 3 הימים הבאים, הפצע של בעלי חיים אלה יש לבדוק באופן קבוע (2-3 פעמים ביום).

התמתחויות של הבטן או היווצרות של מיימת מעידות לזיהומים חיידקיים. אלה עלולים להופיע עקב עבודה שאינה סטרילי במהלך הניתוח. כל הסוג של זיהומים צריך להיות מטופלים ללא יוצא מן הכלל כנקודת סיום הומני ויש להקריב בעלי החיים המושפעים.

אנחנו סיפקנו קל לעקוב אחרי פרוטוקול המאפשר את הביצועים של בד"ל בעכברים, כי הוא פשוט ליישום ומעורר תמותת בעלי חיים רק נמוכה בשילוב עם שחזור גבוה. כל הפרוטוקולים כירורגית ניתן נתפס במהירות על ידי מדענים מיומנים. במהלך הניסויים מלאים, בעלי החיים נשמרים על צלחת התחממות על 37 מעלות צלזיוס ומחוברת באופן קבועלמערכת הרדמה מזעור כאב ומצוקה. לניתוח, הבטן נפתחה עם laparotomy קו האמצע וצינור המרה כפול ligated בלי לנתח אותו. תוצאות הנציג שנדונו כאן מראות כי השינויים פנוטיפי בכל קשור למורפולוגיה כבד (דלקת, פיברוזיס, שחמת הכבד) הם מאוד לשחזור ולאפשר ללמוד היבטים שונים של fibrogenesis (למשל., ייזום, דלקת, התקדמות, בשלב סופי מחלה) בנקודתי זמן מוגדרות.

אנו מקווים שהסיכום של הפרוטוקול שלנו יסייע לקצר את העקומה למידה שיש צורך להקים בהצלחה מודל סיסטיק זה במעבדות אחרות ועל מנת להבטיח תוצאות אמינות ושחזור במקומות שונים. וכך אנחנו חושבים שהפרוטוקול שהוצג תומך בעיקרון 3R שהיה אמור על ידי ראסל וורץ בשנת 1959 ומייצג את יסוד כללי הרווחה החדשים של בעלי חיים שמיושמים כיום במדינות רבות wiדקה המסגרת האירופית.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר את התמיכה הכספית של קרן המחקר הגרמנית (SFB / TRR57, Q3 וQ2). המחברים מודים מרייק שולץ, פסקל Paschenda, וקלאודיה Warzecha על עזרתם בהכנת התמונות.

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Shaver Favorita II	Aeskulap	GT104
Cutter head	Aeskulap	GT730
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Warming plate and controller	Labotect	HP 062
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Scotch Tape	commercially available
Tissue paper	commercially available
Durapore silk tape	3M	1538-1
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes	Lohmann & Rauscher GmbH	33013
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Graefe forceps straight	Fine Science Tools Inc.	11050-10
6-0 Mersilk suture	Ethicon	K889H	Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Colibri retractor	Fine Science Tools Inc.	17000-03
Cotton swabs	Noba Verbandmittel	974202
Cotton swabs	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1032238
25mL beaker	Schott Duran	50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31	Fine Science Tools Inc.	11370-31	Bile duct separation
5-0 Mersilene suture	Ethicon	EH6731H	Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe	BD Discardit II	300296
1mL syringe	BD Plastipak	300013
Sterican needle 26 G x 1	B. Braun	4657683
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp	Petra Electric	IR 11

Referanslar

Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
Russell, W. M. S., Burch, R. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).

Etiketler

Bile Duct Ligation Mice Cholestasis Liver Injury Liver Fibrosis Obstructive Cholestasis Bile Flow Obstruction Surgical Technique Animal Model

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Weiskirchen, S., Borkham-Kamphorst, E., Tolba, R. H., Tacke, F., Weiskirchen, R. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J. Vis. Exp. (96), e52438, doi:10.3791/52438 (2015).