マウスにおける胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

典型的な実験ではBDLは約18〜20グラムの重み付け40雄C57BL / 6野生型マウスで行った。この実験は、16開始段階（3および7日）において、進行（10、14、および20日間）、および長期（30日およ ​​び60日）の間、肝臓の線維形成を調査するために行った。永久実験の終了まで増加門脈周囲の線維症が完全に20日後に開発されたが、このモデルでは、persinusoidal線維症は、既に、手術後10日目に開発し​​た。上記の実験では、簡単な偽手術を受けたすべての動物が生き残った、とだけBDLを受けた40匹のマウス（5％）の2が悪い全身状態を開発し、したがって、早期に実験の計画されたエンドポイントの前に犠牲にした。 BDLを受けた動物のほとんどは最初の3日間に減少した活性を示した偽手術動物の活性は、すでに例外なく開腹後に通常の1日でした。 Jaundiced皮膚は1日か2日BDL 16の設定後にすべてのBDL動物ですでに明らかだった。 肝障害の十分に確立された血清マーカーを表し、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）の両方の値が急激に増加し、7日目及びBDL（表1）20日後の間にピークに達した。その後、ALTおよびASTは30日目まで着実に減少し、60日手術後まで安定していた。胆汁うっ滞性傷害に伴い、総ビリルビンの血清濃度は着実に上昇していたと7日16後にプラトーに達した。 ALTおよびAST血清活動の同様の時間のコースも、BDLを受けたラットで報告された。最近の研究では、血清ASTおよびALTレベルがBDL手術後1週間で正常値の5〜10倍まで増加し、二週間後に19低下したことを実証した。 一般的に、偽手術動物の肝臓はまだスムートを見て実験の終了時の時間、BDLを受けた動物の肝臓は、主に肝臓及び大量の充填されている胆嚢水腫の対応する表面に浮腫および線維性小結節の形成を特徴とする建築の変化を示しているが胆汁（ 図7）。 BDL手術によって誘導される肝の特徴的な形態学的変化は、標準的な組織学的分析（ 図8）においても実証され。 実験の同じセットでは、肝線維症の発症は、半定量的に門脈周囲の線維症が最大を与え、0〜2 0-4及び類洞周囲線維症からステージングされたスコアリングシステムを使用して、盲検病理学者によって評価した肝臓組織学に基づいて評価した。予想されたように6の肝硬変に相当した値は、偽手術動物の群の平均線維化スコアは0.00±0.00であった。トン動物群では対照的に帽子はBDLが、スコアは4.83±0.17の値に60日まで、着実に増加した。門脈周囲線維症のための3の最大値は分析した全ての動物において20日目で到達した、類洞周囲線維症は、実験の最初の10日間、欠席した2週間後に、最初に顕著であった。その後、それは1.8±0.17（ 表1）の値と実験終了まで着実に増加した。 また行われたいくつかの他の独立した動物実験では、線維症の形成は、進行中の線維形成の結果として肝臓内のコラーゲンの発現及び堆積の時間依存的増加（ 図9）を示す高度に再現可能であることが観察された。同様に、進行中の線維のプロセスは、線維芽細胞のマーカーを表し、α平滑筋アクチン（α-SMA）の発現の上昇が顕著である、 すなわち 、肝星細胞とポータル筋線維芽細胞を活性化し、肝ヒドロキシプロリン、豊富コラーゲンマトリックス18（ 図9）に見出されるアミノ酸。さらに、筋線維芽細胞または線維芽細胞の量を増加させる示しビメンチンの発現は、BDL手術20の設定後に増加する。負傷した肝臓における炎症の併存は、さらに強く、急性および慢性肝障害の間に誘導し、急性肝障害21,22の間に肝保護効果を進化さリポカリン2（LCN2）の発現増加によって反映されます。 BDLを受けた動物の肝臓に浸潤する炎症性細胞は、CD45（ 図10）に特異的な抗体を用いて特異的染色によって検出することができる。またPTPRC（タンパク質チロシンホスファターゼ、レセプタータイプ）として知られているこの細胞表面マーカーは、特に、赤血球と血漿細胞を除く全ての分化した造血細胞で発現される。 <table fo:keep-together.withinページ= "常に"国境= "0" cellpadding = "0" cellspacing = "0"> 胆管結紮後の時間（日） 総ビリルビン AST（U / L） ALT（U / L） ポータル線維症 類洞周囲線維症 総得点 量（mg / dL）で 0（n = 3）の 0.17±0.06 192.67±30.50 50.33±6.03 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 3（n = 5）の 6.85±2.21 1159.25±319.27 566.50±335.25 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 7（n = 5）の <td> 14.38±2.14± 976.60±477.16 448.20±259.47 0.60±0.25 0.0±0.0 0.60±0.25 10（n = 5）の 15.92±2.60 1916.60±868.25 560.40±80.88 1.40±0.25 0.25±0.25 1.67±0.25 14（n = 5）の 17.90±3.84 1088.60±276.32 505.00±96.15± 2.4±0.25 1.0±0.0 3.40±0.24 20（n = 4）の 18.00±2.12 1072.67±364.27 404.00±195.48 3.0±0.0 1.0±0.0 4.0±0.0 30（n = 5）の 16.04±4.79 446.40±169.75 260.20±126.97 2.8±。 0.2 1.4±0.25 4.20±0.20 60（n = 6）の 16.02±1.19 484.67±117.79 257.17±50.97 3.0±0.0 1.8±0.17 4.83±0.17 使用される略語は以下のとおりです。ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ。 AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。 表1：線維症は、代表的な実験で得点この表のデータは、肝線維症は、C57BL / 6マウス16内胆管結紮により誘発された研究から再現された。本研究では、BDL手術後の死亡率は5％であった（2 40の動物は、早期に悪い動物条件が開発されているために屠殺した）。 図1：胆汁を行うための実験装置管結紮動物は37°Cの温度で加温プレート上に保持され、操作領域は、流体不透過性、自己接着性ドレープで全体的に覆われている。完全な外科手術の間、動物は、麻酔システムに恒久的に接続されている。すべてのインスツルメンテーションおよび溶液（鎮痛薬、麻酔薬、消毒液、0.9％NaCl）を明らかに配置されている。 図2：手術エリアの調製腹膜腔の前に開口部、腹部の皮膚は、電気毛皮のシェーバーで剃毛し、防腐ガーゼ綿棒で消毒する必要があります。手術領域は、次いで、流体不透過性、自己接着性ドレープで覆われている。腹部を正中開腹（長さ約2センチ）で開かれている。キャビティは、胸骨の保持縫合によって拡散操作領域を挿入することによって拡大される手術中に妨害されていない実験を可能コリブリリトラクターを挿入する。 図3：胆管の露出。それはダイアフラムに固執することができ、肝門部がはっきり見えるように胆管結紮を行ってください（A）は 、肝臓の腹側を持ち上げた。（B）より良い胆管を露出させるために、腸の尾側に移動する加湿綿棒。胆管を矢印でマークされます。 図4：胆管を結紮。 （A）最初のステップでは、胆管に隣接門脈マイクロセレーション鉗子を用いて、肝動脈から慎重に分離されている。（B）続いて、縫合糸の周りに配置されている胆管および外科的結び目で固定。（C）その後、第2の縫合糸は、第1の縫合糸に近接して配置され、胆管の周りに結ばれる。（D）縫合糸が短くなり、キャビティが0.9％NaCl溶液で濯ぎ、およびすべての器官は、それらの生理学的位置に置き換える。 図5：。。と胆管の結びの正確な表現縫合糸の配置や胆汁の流れを妨げる2ノットの設定を文書化するためには、図4に概説したものと同じ手順が両眼の下に記載されていました（A）閉じ込め第1の縫合糸の第1の縫合糸。（B）結び、（C）第2の縫合糸と胆管の閉じ込め。（D）第2の縫合糸の結び。（E）二重ライゲーション胆汁dはUCT過剰縫合糸の短縮後に。（E '）このパネルは、（E）のスケッチを描く。肝臓の左から右（RL）、（llの）の位置と中央値（ml）のローブならびに胆管、胃、十二指腸の文字を付している。スケッチで胆管を二重2本の縫合糸により結紮する。 図6：。胆管、門脈とマウスでは肝動脈の解剖学 、総胆管のより良い解剖学的位置については、門脈と肝動脈は、スキームとして示されている。マークも右（RL）の位置で、左（LL）中央値（ml）及び肝臓の尾状核（CL）のローブ。 図7：代表appeara2週間偽手術とBDL後の肝臓のNCE。 C57BL / 6マウスを操作またはBDL手術を偽に供した。 2週間後、内臓キャビティが開かれた。偽手術動物の肝臓は、線維症の兆候を示さなかったが、胆管の結紮を受けた動物の肝臓は、対応する肝臓の表面上の浮腫と線維性結節の形成を伴う不規則な表面構造を持っていた。 図8：ヘマトキシリンおよびエオシン染色肝臓切片（A）偽手術た3週間（B）が BDLを受信C57BL / 6野生型マウスから調製した。切片は、標準的な手順に従ってヘマトキシリン​​およびエオシンで染色した。炎症の徴候（浸潤細胞）、実質（肝を含むBDL肝臓内の典型的な変化に注意してくださいcyte）壊死、及び胆管の増殖。各図のパネル中のスケールバーは、50μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図9：肝線維化のための組織学的および生化学的な読み出し。 （A）肝臓切片を2週間偽手術またはBDLを受けた動物から調製し、（ 上のパネル、赤のコラーゲン繊維 ）シリウスレッドで染色し、またはα平滑筋アクチン（α-SMA）の発現について分析した（ 下のパネル免疫組織化学による茶色で、α-SMA陽性細胞 ）。各図のパネル中のスケールバーは、100μmを表す。（B）は肝臓からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットにかけ、expreについて分析したよく肝線維のマーカーを確立しているコラーゲンI型、α-SMA、およびビメンチンのssion。リポカリン-2（LCN2）の発現は、進行中の線維に関連付けられている炎症反応を示している。この分析では、等しいタンパク質負荷は、βアクチンに特異的な抗体とブロットをプローブすることによって実証された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図10：炎症細胞浸潤の免疫学的染色シリアル肝臓切片は、3週間の胆管結紮を受けた動物の肝臓から調製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（A）またはCD45（B）に特異的な抗体で染色した。ご注意ください、胆管周囲のCD45陽性細胞の数が多い。炎症を示すこれらの大規模な浸潤が、偽手術動物由来の肝臓切片には表示されません（図示せず）。各図のパネル内のスケールバーは500μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。