の栽培<em> Heligmosomoides Polygyrus：</em>免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

注：このプロトコルですべての手順は、英国内務省とエディンバラ獣医サービスの大学が定めたガイドラインに従って行われる。 強制経口マウスの1。感染 4℃で6ヶ月までのための蒸留水に保管Heligmosomoides polygyrus L3幼虫。 使用前に、L3幼虫を蒸留水で3回洗浄：（ブレーキ付）10分間300×gで遠心分離し、水500μlのが、すべてを削除（ペレット化L3幼虫を乱さないように）、ペレットたびに懸濁します。 3回目の洗浄のために、その開口部を広げる正確なボリューム（通常は40ミリリットル）と吸引200μlの先端カットで20μlに水を加える。 60mm培養皿の表面にある2つの20μlのサンプルを配置し、（通常はモバイル、最高の解剖顕微鏡で50倍の倍率で見て）L3幼虫を数える。 concentratio蒸留水で最終ペレットを再懸濁1mlあたり2000 L3幼虫のN。 ライフサイクルの生産のために、8週齢のF1（C57BL / 6xCBA）マウスは、400 H.で感染経口胃管栄養法により蒸留水200μl中polygyrus L3幼虫（首筋によって直立位置でマウスを拘束し、静かに胃に口や食道を通っ鈍い強制経口針を渡す）。攪拌各感染症（幼虫は水に迅速に解決する）と吸引1mlシリンジで200μlの前に十分。丸みを帯びた端部を有する専用の強制経口針を使用しています。 （6〜8週齢）若いマウスの実験的感染、または他の近交系（ 例えば 、C57BL / 6またはBALBC）の場合は、200 L3幼虫をマウスに感染させる。 2.伝播とHのメンテナンスpolygyrus 大型プラスチック浴槽の中央に炭を置き、冷たい水道水を最低30分間​​その上で実行できるようにする（未洗浄活性炭は、L3幼虫に対して毒性である）。水槽から水を排出し、T ON炭を置く吸収紙の層WO、それが完全に乾燥するまで室内空気にさらされたまま。 卵が必要な場合は（必要に応じてハサミ）、最初の鉗子とコロンから糞をこすり。 L3幼虫の多数が必要な場合、ワイヤーグリッド上にマウスを置き、数日間の糞を収集する。 濾紙に付着するのに十分なだけ、湿った一貫性を達成するために、1：1以上の割合で造粒炭と糞便を混ぜる。ペトリ皿にいくつかの湿らせたろ紙の中央に薄い層を塗抹し、12〜14日、暗所で（一部の湿ったペーパータオルと水の一品を追加）湿潤箱にこれを配置します。 以降7日目からL3幼虫を外し、紙が廃棄される前に、少なくとも2の機会をそれらを集める。幼虫はろ紙のエッジの周りにリングを形成する。ペトリ皿から濾紙を持ち上げて、50mlのチューブに（ピペット、プレートあたりの滅菌水5mlを用いて）、プレートの左右され幼虫をすすぐ。 リフトろ紙から、残りの幼虫を収穫を50mlチューブに蒸留水を用いてプレート上に残した。 10分間300×gで流出溶液を遠心します。蒸留水で幼虫を3回洗浄した後、必要になるまで蒸留水の最大50ミリリットルで、4℃で保存する。 注：幼虫が生存したままで少なくとも6ヶ月間感染性。 大人Hの3コレクションpolygyrusワーム 図1に示すように、事前に修正されたベールマン装置を準備します。 14日、感染後カルマウス。 70％エタノールで腹部を洗ってください。腹部の皮膚をカットし、前腹壁を明らかにするために引き戻す。腹膜腔を入力するように正中切開を行います。 （遠位直腸への近位十二指腸から）全体の小腸および大腸を削除します。ドライペトリ皿に置きます。 その全長に沿って腸をまっすぐに。消費税​​糞含有コロン。後で卵の準備のために別々の皿にこれを置く。 物品税によるもの腔内ワームに十二指腸の比較的厚い壁と、多くの場合、赤の出現によって-identified成虫が含まれている小腸の近位20センチメートル。ハンクスソリューションを5 mlの（直径100mm）ペトリ皿に置き、37℃（ディッシュあたり2つの試料）に温めた。 ハサミで縦方向にワームで満たされた近位腸の部分を開きます（ラウンドエンド型ハサミはこのために最善である）、およびワームを削除するには2枚のスライドガラスライニング腸の内側にダウンこすり。その後、きれいな腸壁を捨てる。 小さ ​​なモスリン袋にヒントワームは、主食は閉じられ、ガラス漏斗（ 図1）のエッジの周りペーパークリップで固定します。 ハンクス液で漏斗を記入し、それぞれの漏斗内にワームの約4ペトリ皿を追加します。 優しく除去するために通過途中を攪拌する1〜2時間、37℃のインキュベーター内の場所装置、モスリンフィルタを閉塞することができる腸の準備から破片。モスリンバッグ外側の破片の流出を避けるために注意してください – これは、最終的なHES製剤の汚染の原因となります。成虫はゆっくりモスリン布を通って移動し、ガラス試験管の底に沈降している必要があります。慎重にシンク（この時点でワームを失わないように注意しながら）経由で接続ゴムホースから試験管を取り外してください。 プラスチックピペットを用いて、50ミリリットルチューブにワームを転送し、 '（ワームは、重力との和解stripetteでメディアを取り出し、ハンクスの40ミリリットル追加できるようにソリューション」ソリューションと5回繰り返す）ハンクスで6回洗う。 注：このワーム文化はこれ以降から無菌に保つ必要があります。 層流フードに移動し、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン、 インビトロ培養の準備ができて補充した無菌ハンクス液で別の6回洗浄する。 カウントその開口部を拡大する黄色の先端カットに取り20μlの二つのサンプルを取ることによって回収成虫。接種した幼虫の量の約50％を期待しています。 培地調製、成虫を洗浄：4. HESのための文化を設定する RPMI約10mlの3.11から虫を浸すワームが完全に覆われるようにする角度でチューブ止まり、20分間、10％のゲンタマイシンを補充した。 層流フードでこれを実行します（5 U / mlペニシリンおよび5μg/ mlのストレプトマイシンを補充）ハンクス液で再び6回洗浄する。 H.を準備polygrus媒体 。 100倍Peniclllin – ストレプトマイシン（最終濃度5 U / mlペニシリン、5mlの、（RPMI1640 0.2％グルコースを含有するもので、最終濃度1.2％）45％グルコース11.1ミリリットル追加、RPMI1640の500mlに、層流フード内で無菌性を維持する5μg/ mlのストレプトマイシン）、L-グルタミン（最終濃度2mM）を5mlの、及びゲンタマイシン（最終濃度1％）を5ml。 FCSを追加しないでください。 通気T25フラスコにアリコートワーム、約。 15ミリリットルH. 1,000ワームpolygyrusフラスコ当たり媒体、及び37℃のインキュベーター（5％CO 2）3週間で直立場所。 HESの5。準備 （ – 別々に処理または廃棄することができる起因するLPS混入と宿主タンパク質の高レベル）培養24時間後の最初のコレクションはさておき設定、もはや週2回以上の間隔で培養物からHES含有培養培地を収集します。個別の各コレクションを維持し、明確に日付とバッチ番号で標識した。 H.等量のと交換してください各機会にpolygyrusメディア 。 5分間400×gで遠心HES含有培地。その後、50ミリリットルチューブに0.2ミクロン低タンパク質結合フィルターを通して滅菌ろ過する。 -20℃の冷凍庫に保管しては明らかにHES cのワームの収穫の日付と日付で標識したollection。 培養物からHESコレクションの21日後に、ワームを捨てる。 （通常、凍結ストックから、そして最初の24時間のコレクションを含まない）と窒素圧力下で限外濾過装置で3000 MWCOフィルター上で濃縮するHES上清のプール500〜1,000ミリリットル。 注：フィルタの実行を乾燥させるないように注意してください。 フィルタ装置を設定するには、最初に撹拌しながら3×20分間蒸留水で1リットルのビーカーにダウン3 kDaの膜光沢のある側を洗う。フィルター膜光沢のある面を上にして、製造業者の指示に従って限外ろ過装置を組み立てます。 4℃でのキャビネットに置き、そしてプールHESを濃縮するために開始する前に通って蒸留水50mlを渡す。 必要に応じてボリュームが2〜5ミリリットルに濃縮されるまで、（1日100〜140ミリリットル）濾過装置にHESの各チューブを追加します。 HES含有培地から汚染物質を除去するために、pyrで50mlのを追加その後、濾過装置にフィブリノーゲンを含まないPBSとし、約2mlまで濃縮する。二回（合計でPBSの150ミリリットル）、この手順を繰り返します。フィルタは、層流フード内（0.2μmフィルターで）滅菌し、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、15mlチューブにHESを移す（E 280 = 10）またはBradfordアッセイによって。 アリコート、バッチ番号と日付ラベル、および-80℃で凍結する。 使用前にHESの各バッチに、製造業者のプロトコールに従って、発色性LALアッセイを行う。 LPSレベルは1μgタンパク質あたり1 U LPSよりも大きい場合には、in vivoでの実験のためにまたはインビトロ培養において 、このバッチを使用しないことを検討してください。 同様に、別々に24時間後に収集したHESを処理します。それは、機能の実験には適していないが、それはモノクローナル抗体の親和性精製によって単離することができるよう、個々の分子の有用な供給源であり、LPSおよびいくつかの宿主タンパク質を含有します。 </ol>