재배<em> Heligmosomoides Polygyrus :</em> 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 영국 홈 오피스 에딘버러 수의학 대학에서 정한 지침에 따라 수행된다. 위관 마우스 1. 감염 6 개월까지 4 ° C에서 증류수에 보관 Heligmosomoides polygyrus L3 유충. 사용 전에 증류수에 L3 유충을 세 번 세척 : 원심 분리기 (브레이크) 10 분 300 XG에, 물을 제외한 모든 500 μl를 제거 (방해 펠렛 L3 유충을 피하기 위해) 및 펠릿 때마다 재현 탁. 세 번째 세척의 경우, 그 구멍을 넓혀 200 μL 팁 컷 정확한 볼륨 (일반적으로 40 ml) 및 흡인 20 μl를 물을 추가합니다. (모바일 및 최적의 해부 현미경으로 50 배 확대하여 봅니다 보통) 60mm 배양 접시의 표면에 두 개의 20 μL 샘플을 놓고 L3 유충을 계산합니다. concentratio 증류수에 최종 펠렛을 재현 탁1 ㎖ 당 2,000 L3 유충의 명. 라이프 사이클 생산을위한, 400 H. 8 주 된 F1 (C57BL / 6xCBA) 쥐를 감염 구강 투여에 의한 증류수 200 μL에 polygyrus L3 유충 (목덜미에 의해 수직 위치에 마우스를 억제하고 부드럽게 위장으로 입과 식도를 통해 무딘 위관 바늘을 통과). 선동 각각의 감염 (유충은 물에 빨리 정착) 및 흡인 1 ML의 주사기에 200 μL에 철저하게 사전; 끝이 둥근로 전용 위관 바늘을 사용합니다. 젊은 쥐의 실험 감염 (구 6~8주), 또는 다른 근친 균주 (예 : C57BL / 6 BALBc)의 경우, 200 L3 유충 쥐를 감염. 2. 전파 및 H. 유지 보수 polygyrus 대형 플라스틱 욕조의 중심에 숯을 넣고 차가운 수돗물을 최소 30 분을 위해 그것을 통해 실행 할 수 있습니다 (씻지 않은 활성탄 L3 유충에 독성). 욕조에서 물을 배출하고 t에 숯을 배치완전히 건조 될 때까지, 실내 공기에 노출 떠나는 흡수지 층, WO. 계란이 필요한 경우 (필요한 경우 가위), 최초의 집게로 결장 중 대변을 다 쳤어요. L3 유충의 다수가 필요한 경우, 와이어 그리드에 마우스를 위치시키고 며칠 동안 분변 펠렛을 수집한다. 다만 종이 필터에 부착 할 정도로 감쇠 일관성을 달성하기 위해, 한 적어도 하나의 비율로 과립 숯 대변 섞는다. 페트리 접시에 일부 젖은 필터 종이의 중앙에 얇게 바르고 습기 상자에이 배치 12-14일의 어둠 속에서 (일부 젖은 종이 타월과 물 접시를 추가). 이후 7 일에서 L3 유충을 제거하고 용지가 폐기되기 전에 적어도 2 번의 그들을 수집합니다. 애벌레는 여과지의 가장자리 주위에 고리를 형성하고; 페트리 접시에서 필터 종이를 들어 올려 50 ㎖ 튜브에 (펫 및 플레이트 당 멸균 물 5ml를 사용하여) 판으로 남아있는 유충을 씻어. 승강기및 여과지 오프 나머지 유충 50 ㎖ 튜브에 증류수를 플레이트에 남아 수확. 10 분 동안 300 XG에 유출 물 용액을 원심 분리기. 증류수로 유충을 세 번 세척하고 필요한 때까지 증류수 50 ml를 4 ° C에 저장합니다. 주 : 유생 생존을 유지하고, 적어도 6 개월 이상 감염성. 성인 H. 3. 컬렉션 polygyrus 웜 도 1에 도시 된 바와 같이 미리 변형 Baermann 준비 장치. 십사일 감염 후 발췌 마우스. 70 % 에탄올로 복부를 씻으십시오. 복부를 통해 피부를 잘라 전방 복벽을 공개 철수. 복강를 입력 정중선 절개를합니다. (원위부 직장에 근위 십이지장에서) 전체 크고 작은 창자를 제거합니다. 건조 페트리 접시에 놓습니다. 전체 길이를 따라 장을 직선화; 대변​​ 함유 대장을 절제; 나중에 계란 준비를위한 별도의 접시에이를 배치합니다. 때문에 내 내강 벌레 십이지장 종종 붉은 모양의 비교적 두꺼운 벽에 의해 증명되는 어른 벌레가 포함되어 소장의 근위 20cm를 절제. 행크스 '액 5 mL를 (100mm 직경) 페트리 접시에 놓고, 37 ° C (접시 당 두 개의 표본)로 가열. 가위 (라운드 종료 가위이 가장 아르)와 종 방향 웜 가득 근위 창자 부분을 열고 웜을 제거하기 위해 두 개의 유리 슬라이드 라이닝 장 내부에 아래로 긁어. 그런 다음 깨끗한 창자 벽을 폐기합니다. 작은 모슬린 가방에 팁 웜, 주식 폐쇄 및 유리 깔때기 (그림 1)의 가장자리 주위에 클립으로 고정합니다. 행크스 '솔루션으로 깔때기를 작성하고 각 깔때기에 웜의 약 4 페트리 접시를 추가합니다. 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C 배양기에 넣어 장치, 부드럽게 반까지 교반하면 빠지지모슬린 필터를 막다 수있는 장 준비에서 파편. 모슬린 가방 외부 이물질의 유출을 방지하기 위해주의 -이 최종 HES 제제의 오염의 원인이됩니다. 성인 웜 천천히 모슬린 천 통해 이주 및 유리 시험관의 하단에 정착한다. 조심스럽게 (이 시점에서 웜을 잃지 않도록주의하면서) 싱크를 통해 연결 고무 호스에서 테스트 튜브를 분리합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 웜을 전송하고 씻어 여섯 번 행크스와 함께 '솔루션 (웜 stripette와 미디어, 중력 침전 제거 할 수 있도록 허용, 추가 행크스의 40 ml의'솔루션을 다섯 번 반복). 참고 : 웜 문화는 이후이 시점에서 멸균 보관해야합니다. 층류 후드로 이동 100 U / ml의 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 체외 문화에 대한 준비와 보충 멸균 행크스 '솔루션에 다른 여섯 번 씻는다. 카운트그 구멍을 넓혀 노란색 팁 인하와 함께 찍은 20 μL의 두 샘플을 채취하여 복구 어른 벌레; 접종 유충의 양의 약 50 %를 기대합니다. 중간 준비, 성인 웜을 세척 4. HES에 대한 문화를 설정 RPMI의 약 10 ml의 3.11에서 벌레를 적시는 벌레가 완전히 덮여 수 있도록 각도로 튜브 휴식을 떠나, 20 분 동안 10 % 겐타 마이신으로 보충. 층류 후드에서이 작업을 수행 행크스 '솔루션 다시 여섯 번 씻어 (5 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신). H. 준비 polygrus 미디어. 11.1 ml의 45 % 글루코오스 (최종 농도 RPMI1640 0.2 % 글루코스를 포함 1.2 %), 100 × Peniclllin – 스트렙토 마이신 (최종 농도 5 U / ㎖ 페니실린 5 ㎖를 넣고 500 RPMI1640 ml의, 층류 후드에서 무균 유지 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신), L 글루타민 5 ㎖ (2 mM의 최종 농도) 및겐타 마이신 5 ㎖ (최종 농도 1 %). FCS를 추가하지 마십시오. 배출 T25 플라스크로 나누어지는 웜, 약. 15 ML의 H. 1,000 벌레 polygyrus 플라스크 당 미디어, 37 ° C 배양기 (5 % CO 2) 삼주에 대한 정직한 곳. HES 5. 준비 문화의 24 시간 후 첫 컬렉션을 따로 설정, 두 번 일주일 이상 더 이상 간격으로 문화 문화 매체를 HES가 함유 수집 (때문에 LPS 오염 및 호스트 단백질의 높은 수준 – 개별적으로 처리하거나, 삭제할 수 있습니다). 별도의 명확 날짜 및 배치 번호가 표시 각각의 컬렉션을 유지합니다. H. 같은 부피로 교체 각 행사에 polygyrus 미디어. 원심 5 분 동안 400 x g에서 미디어 HES가 함유. 이어서 50 ㎖ 튜브에 0.2 ㎛의 저 단백질 – 결합 필터를 통해 살균 필터. -20 ° C 냉장고에 보관 명확하게 HES (c)의 웜 수확의 날짜와 날짜 표시ollection. 문화 HES 컬렉션 21 일 후, 벌레를 폐기합니다. (보통 냉동 콘텐츠로부터, 상기 제 24 시간 컬렉션을 포함하지 않음), 및 질소 가압하에 한외 여과 장치에서의 필터 3000 MWCO를 통해 농축 HES 상청 500-1000 ml의 풀. 참고 : 필터 실행 건조 들어 가지 않도록주의해야합니다. 필터 장치를 설정 첫째 교반하면서 3 × 20 ​​분 동안 증류수 1 리터 비이커에 아래 3 kDa의 막 반짝이는면을 세척합니다. 필터 멤브레인 광택면을 위로하여 제조업체의 지침에 따라 한외 여과 장치를 조립합니다. 4 ° C에서 캐비닛의 장소 및 풀링 HES을 집중하기 시작하기 전에를 통해 증류수 50 ㎖를 전달합니다. 볼륨이 2-5 ml의 농축 될 때까지 (하루에 100-140 ml)을 필요에 따라 여과 장치에 HES의 각 튜브를 추가합니다. 피라 50 ㎖를, HES – 함유 배지에서 오염물을 제거하기 위해서 추가PBS 및 여과 장치 및 ogen없는 한 다음 약 2 ㎖의 아래로 농축시킨다. 두 번이 단계 (총 PBS 150 ㎖)를 반복합니다. 층류 후드에서 15ml의 튜브 (0.2 μm의 필터) 필터 소독 HES로 옮기고, 분광 광도계 (10 E = 280) 또는 브래드 포드 분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정한다. 나누어지는, -80 ° C에서 배치 번호와 날짜, 동결 레이블. 사용하기 전에 HES의 각 배치의 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 LAL 분석을 수행합니다. LPS 레벨은 1 μg의 단백질 당 1 U LPS보다 많은 경우, 생체 내 또는 시험 관내 실험 배양이 배치를 사용하는 것을 고려하지. 별도로 동일하게 24 시간에 수집을 HES 방법; 적합하지 기능적 실험 그것이 모노클로 날 항체의 친 화성 정제에 의해 단리 될 수있다 개별 분자의 유용한 소스가있는 동안은, LPS 및 일부 숙주 단백질을 포함 할 것이다. </ol>