Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Matthias Ernst; Adele Preaudet; Tracy Putoczki

doi:10.3791/52383

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

Canlı Fareler Seri endoskopik Görüntüleme kullanma Bağırsak Patolojilerde Yeni Therapeutics Etkinliğinin Non-invaziv Değerlendirme

Published: March 10, 2015

doi:

10.3791/52383

Matthias Ernst^1,2,3, Adele Preaudet¹, Tracy Putoczki^1,2

¹The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, ²The Department of Medical Biology,University of Melbourne, ³Olivia Newton-John Cancer Research Institute

Özet

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

Kolorektal kanser (CRC) malignite dünya çapında ^{1 4.} en sık nedenidir. Bu hastalığın ailesel bazda anlayışımızda önemli ilerlemeye rağmen, genetik yatkınlık, sadece CRC olguların ² ~ 20% katkıda bulunmaktadır. kalan kronik inflamasyon dahil çok sayıda dış ve çevresel faktörlere, atfedilir. İnsanlarda, kronik inflamasyon ve kolon kanseri arasındaki bağlantı ülseratif kolit kolit ilişkili kolon kanseri (CAC) gelişme riski daha yüksektir (UC) hasta, belirgin bir enflamatuar hastalık ³ süresi, kapsamı ve şiddetine bağlı olarak ^-5. Buna göre, yeni tedaviler bağışıklık tepkisini ve enflamatuar tümör mikroçevresinin ^6-8 büyüme teşvik faktörlerin ilişkili üretimini kontrol etmek geliştirilmektedir. Terapötik etkinliğini karakterize etmek için uygun olan klinik öncesi hayvan modellerinde için giderek artan bir gereksinim vardırgelişimi ve hastalığın ilerlemesine karşı bu ilaçlar.

Fare model tümden enflamatuar mikro-ortam daha açık enflamasyon ^9,10 yokluğunda, CRC ilerlemesine katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu modeller, epitel yaralanması, akut ve kronik iltihaplı bağırsak hastalığı (IBD), ^11,12 model farelerin içme suyu temin polisakarit dekstran sülfat sodyum (DSS) kullanımını, içerir. DSS mukozal hasarı ve kolit indüklediği mekanizması tam olarak anlaşılmamıştır, ancak, bazı çalışmalar DSS hücre içinde hücresel ters transkriptaz ve ribonükleaz faaliyetlerini inhibe eden veya kolon zar zarar epitel gelen füzyonu nano lipid kompleksleri oluşumuna neden olduğu gösterilmiştir ^13,14. Standart DSS modeline değişiklikler de kolon epitel hücreleri, doku homeostazisini ve kirecin muntazam aralıklar ile devam hangi mekanizmaları içine önemli fikir vermişGeç mukozal bağışıklık tepkileri ^15.

Azoksimetan (AOM) verildi ve tek başına, ya da DSS ile birlikte, epitel mukozası ve inflamatuar ve stromal mikroçevresinin ^16,17 somatik mutasyonlar arasındaki etkileşimi inceleyen bir model sağlar. AOM doğrudan DNA mutasyonlarının sonuçlanmaz kanserojen 1,2-dimentihidrazin (DMH) bir metabolitidir. Bunun yerine, AOM MAM glukuronik asit ile konjüge edilmiş ve daha sonra, safra salgıları ¹⁸ barsak taşınır karaciğer, sitokrom izoform CYP2E1 ile (MAH) methylazoxymethanol için hidrolize edilir. Bakteriyel β-glukuronidaz, DNA alkilleme sonuçlanan MAM bozulması ve epitel hücreleri ¹⁹ mutasyonların birikimine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. En AOM uyarmalı kolon tümörleri proteozomal degradati dayanıklı protein işleme, gen kodlayıcı β-katenin missense mutasyonu taşıyankanonik Wnt sinyal yolunun ^20-anormal aktivasyonu ile sonuçlanır, üzerinde. AOM aktivitesi DSS tarafından ortaya mukozal hasar ile kombine edildiğinde, yanıtı şifa izleyen yara Mutajenize epitel büyüme ve genişleme için elverişli bir mikro oluşturur. Bu modelin bir varyasyonunda, tek başına bir kaç haftalık bir süre boyunca AOM tekrarlanan uygulama DDS ile indüklenen kolit ^10,17 yokluğunda, sporadik kolorektal kanser modellemek için de kullanılabilir. Bu iki tamamlayıcı model bir pro-enflamatuar tümörün mikro ¹⁰ ile bağlantılı olan, her ikisi de sırasıyla CAC ve sporadik CRC çalışma deneysel ayarları sağlar.

farelerde seri endoskopinin kullanımı Becker ve arkadaşları ²¹ tarafından öncülük ve kolit ve tümör ilerlemesi boyuna izlenmesini sağlar edildi. Burada DSS-kaynaklı mukozal hasar ve / veya AOM-aracılı tu dayalı üç klinik öncesi protokolleri sağlamakmor indüksiyon tekrarlanabilir özel kolon patolojileri ikna etmek. İlk protokol İBH ile ilişkili histopatolojik özellikleri birçok ortaya çıkarmak için DSS yönetimine tepki akut mukozal hasar uyarılması açıklar. İkinci protokol yaygın İBH hastada inflamasyon fişekleri taklit DSS yaklaşık üç ardışık döngü dayanır ve AOM kaynaklı mutasyonlarla bağlantılı olarak gerçekleştirilebilir. Nihai protokol AOM-kaynaklı sporadik epitel mutasyonlara dayanır. Bu protokollerin her biri için, biz yeni ilaçların etkinliğini izlemek için geliştirdik profilaktik ve terapötik müdahale yöntemlerini içerecek şekilde ilgili standart prosedürleri genişletin.

Protocol

Tıbbi Araştırma hayvan etik kurul Walter ve Eliza Hall Enstitüsü bu protokollerin açıklanan prosedürlerin her onayladı. Deneysel Fareler hazırlanması 1. En az 4 cinsiyet deneysel kohortlardan oluşturun yetiştirilen ve aynı spesifik patojen free (SPF) hayvan tesisi / odada muhafaza ve otoklava yiyecek ve su ile sağlanır 6-8 haftalık C57BL / 6 fareler (M. musculus) eşleşti. dişi farelerin kullanılması farklı çizgiler, sınır kutusu numaralarından gelen farelerin eş-konut izin ve kafes-to-kafes varyasyonu azaltacaktır. 3.0 mm çaplı endoskopi kılıf kullanarak endoskopi prosedürleri etkinleştirmek için yaş en az 6 hafta farelerin olun vardır. Mümkün olan yerlerde bağırsak mikroflorası ile ilgili varyasyonları azaltmak için aynı rafta depolanan kafeslerden, aynı genetik arka plan fareler kullanın ve. Hayvan tesisleri arasında mikroflora varyasyonlar göz whe alınmalıdırn her bir deney için 22 uygun kontrol fareleri ve genotipleri belirlenmesi. Kulak / burun kupürleri, dövmeler, ya da benzeri işaretle fareler kolay tanımlama için izin vermek. Bazal deneysel ağırlıkların belirlenmesi için, Gün 0 üzerine fareler tartılır. Endoskopi gerçekleştirin bazal kolon fenotipleri kaydetmek için Gün 0 üzerine farelerin (Bölüm 5). Bir Epitel Hasar ve Akut Kolit Modelinde 2. Ön-klinik Deneme Terapötik madde ihtiva eden bir çözelti hazırlayın, test edilecek. Oral gavaj (PO) tarafından teslim edilen terapötik, 100 ul bir maksimum hacme kadar çözüm hazırlanması. Intraperitonal (ip) enjeksiyon ile tedavi için, 200 ul bir maksimum hacme çözüm hazırlanması. NOT: uzun süreler boyunca tekrarlanan ip veya po ilaç uygulaması değişmiş fare davranışlara neden olabilir. Uzun süreli rahatsızlık önlemek için ip enjeksiyon sitesini alternatif. Po uygulama için, autoc farelere sağlamakBir 'tedavi' olarak laved ayçiçeği tohumu sonda prosedürü ile olumsuz bir ilişki aza indirmek için. 1. Günde çıkar (aşama 2.1'de elde edilmiş) ve uygun bir araç kontrol terapötik uygulayın. Örneğin Resim (Şekil 6A), rekombinant insan (rh) iInterleukin (İL) a sahip 5 ug -11 proteini, 200 ul fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde çözüldü (PBS) ve kullanılan IP . Test ediliyor tedavi reaktif kurulan farmakokinetik profili bağlı olacaktır idarelerin, zamanlaması ve sıklığını belirlemek 1 deney boyunca günde iki kez ip enjeksiyonları kullanarak profilaktik tedaviyi özetliyor Şekil. Dışkı kıvamı ve kan varlığı da dahil olmak üzere, Monitör ve günlük her fare tartın. Tedavinin günlerde, terapötik ilaç idaresi denk olmalıdır tartı tekrarlanan kullanım nedeniyle farelere stres en aza indirmek için. </li> Gün 3,% 2.5 (2.5 g / 100 mi) rutin hayvan tesisine göre farelere sağlanan içme suyu DSS solüsyon hazırlanır. Yaklaşık 5 ml / fare / DSS çözeltisi günlük deney için gereklidir. hayvan tesis ortam sıcaklığı dalgalandığı eğer DSS su tüketimi değişebilir. NOT: DSS tahriş edicidir ve MSDS talimatlara uygun olarak ele alınmalıdır. 5 Sürekli gün temiz su şişeleri fareler istenildiği kadar taze DSS sağlayın. Gün 5 akşamı, püre gıda pelet ek ve küçük petri kaplarına (100 gr gıda pelet / 10 gr protein shake / 10 ml su) sağlanan bir protein takviyesi normal içme suyu sağlamak. Bu kurumasını engeller ve ciddi kilo kaybı minimize yardımcı olur. CO2 zehirlenmesi fareler öldürülür ve 8. gün veya sabahında, sonraki histolojik analiz için dokular toplamak farenin en fazla üç c ≥15 ağırlıkça%-kaybına uğradığı zamanİlk hangisi onsecutive gün. NOT:% 1-4 arasında DSS dozunu ayarlayın (w / v) hayvan tesisinin mikroflora ve DSS toplu bağlı. Uygun DSS dozajı ve circumvent partiden partiye varyasyonu kurmak için, rutin parti testi yürütmek. Uygun dozaj kilo kaybı (orijinal ağırlığının daha büyük olmayan% 15) göre ve kolit histopatoloji doğrulanmalıdır. Kronik Kolit veya Kolit-ilişkili Kanser Modeli 3. Ön-klinik Deneme Kronik kolit modeli için adım 3.7 başlayın. Kolit ilişkili bir kanser (CAC) model için, Gün 1, 10 mg / kg (ağ / ağ) azoksimetan (AOM, 250 ul, ip) her fare enjekte edilir. NOT: AOM kanserojen ve MSDS talimatlara uygun olarak ele alınmalıdır. AOM stok çözeltileri, 10 mg / ml'lik miktarlar halinde hazırlandı ve -20 ° C'de saklanır. Enjeksiyon gününde, AOM stok çözeltisi eritilir ve 1 mg / m seyreltildiPBS içinde l. Tekrarlanan donma ve AOM stok çözeltisi çözülme kaçınılmalıdır. AOM dozu 8-12 mg / kg arasında ayarlanabilir. Rutin parti denemeleri partiden partiye varyasyonuna farelere toksisite aşmak için uygun AOM dozajı oluşturmak için gereklidir. Gün 1-7 boyunca AOM uygulama ağırlıkları stabil bir sonraki olur ve bu nedenle, kilo kontrolü, bunların dışkılarında sitotoksik metabolitleri salgılamak olacaktır taşıma hayvanlar bilmek gün 1-7 sırasında ihmal edilebilir. 7. günde, tüm yatak sitotoksik prosedürler takip değiştirilmesi gerekir. Yatak değişim işlemi tamamlandıktan sonra artık sitotoksik metabolitleri salgılayan edileceği gibi, hayvanlar, artık sitotoksik işleme prosedürleri gerektirmektedir. 8. günde,% 2.5 (2.5 g / 100 mi) (adım 2.5 de tarif edildiği gibi), DSS çözeltisi hazırlamak ve fareler ad libitum olarak sunulmaktadır. Karıştırdı fu dahil, deney boyunca günlük fareler tartılır ve hastalık belirtilerini izlemekr, kanlı dışkı ve az hareket hunching. Gün 13, DSS çözüm kaldırmak ve 28. Gün 8-28 kronik kolit / CAC protokolünün bir 'döngüsü' oluşturan gününe kadar normal içme suyu ile fareler sağlamak. Gün 13-28 üzerinde farelerin, normal içme suyu verildiği zaman, püre gıda pelet ile fareler ve küçük petri kaplarına (100 g gıda pelet / 10 gr protein çalkalama / 10 ml su) içinde temin edilen bir proteini ek sağlar. Bu kurumasını engeller ve ciddi kilo kaybı minimize yardımcı olur. NOT: püre protein takviyeleri fareler DSS tüketim tutarlılığı sağlamak amacıyla içme suyu DSS içeren alırken temin edilmemelidir. Gün, 20 (Bölüm 5) bireysel fare sağlığını izlemek için ikinci endoskopik muayene. Gün 29 tekrarı üzerinde DSS döngüsü (Döngü 2:% 2.5 (v) Günleri 34-50 döneminde Günleri 29-33 ve normal içme suyu sırasında sağlanan DSS w /). Gününde 40 thi gerçekleştirmekBireysel fare sağlığını izlemek ve tümör yükünü belirlemek için endoskopik muayene rd (Bölüm 5). Tümör yok Günü 40 endoskopi ile görünür ise, Gün 50-72 üçüncü bir DSS döngüsü başlar (Döngü 3:% 2.5 (/ v) Günleri 56-72 döneminde Günleri 50-55 ve normal içme suyu sırasında sağlanan DSS w). Genellikle, tümörler Gün 40 olarak görünür ve bu nedenle DSS üçüncü döngü atlanabilir vardır. Tümörler endoskopik muayene ile görünür hale kez, her fareye bir endoskopik tümör puanı (Bölüm 5) atamak ve benzeri temel tümör yüklerin ile kohortlarda bireysel fareler atayın. (Tümörler görülebilir olduğunda ya) Günün 42, terapötik bileşik veya ilgili araç kontrolü (Bölüm 2.2 bakınız) yönetmek. doz zamanlaması terapötik farmakokinetik profili bağlı olacaktır. Bir müdahale tedavisi bir örneği şöyle sağlanmıştır yer almış tümörlerin (Şekil 2) olan farelerde, haftada üç kez ip enjekte edilmiştir. E gerçekleştirinterapötik tedavi süresi boyunca haftada bir kez ndoscopic sınav tümör yükünü izlemek için. Genel olarak, terapötik tedavi 4 haftalık bir amacı, tedavi yanıtını izlemek için yeterli olacaktır. Tedavinin kesilmesinden sonra, farelerin bir kohort, tümör nüksü için endoskopi ile izlenebilir. CO zehirlenmesinde 2 fareler Euthanize ve fareler fazla üç gün üst üste ≥15% kilo kaybı karşılaştığınızda veya ilk gelenden Gün 72 sabahı biyokimyasal ve / veya histolojik analiz için doku toplamak. Bir Sporadik Kolorektal Kanser Modeli 4. Ön-klinik Deneme Gün 1, 10 mg / kg AOM (adım 3.2) ile her fare ip enjekte. AOM dozu 8-12 mg / kg arasında ayarlanabilir. Rutin parti denemeleri partiden partiye varyasyonuna farelere toksisite aşmak için uygun AOM dozajı oluşturmak için gereklidir. Her haftanın ilk gününde enjeksiyon tekrarlayınAşağıdaki 5 hafta içinde (Şekil 3). fareler tamamı 6 hafta boyunca sitotoksik güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalıdır. Tekrarlanan kullanım nedeniyle farelere sıkıntı en aza indirmek için AOM enjeksiyon gününde her fare tartılır. NOT: AOM kanserojen ve MSDS talimatlara uygun olarak ele alınmalıdır. Bütün hayvanlar, bu protokol için gerekli AOM ip enjeksiyonları 6 hafta boyunca sitotoksik güvenlik prosedürlerine göre ele alınmalıdır. Haftada 8 içinde ortaya çıkan tümörlerin (Bölüm 5) izlemek için endoskopik muayene. Tümörler görünür hale gelene kadar Endoskopik muayene iki haftada yapılmalıdır. Genel olarak, vahşi tip C57BL / 6 fare AOM ilk uygulamadan sonra yaklaşık 40 hafta tümör oluşum başlar. Tümörler endoskopik muayene ile görünür hale kez, her fareye bir endoskopik tümör puanı atamak (Bölüm 5) ve benzeri ile bir kohort bireysel fareler atamak terapötik tedavi başlamadan önce tümör yükü. (Tümörler görülebilir ilk olduğunda ya) haftada 40 boyunca, terapötik bileşik veya ilgili araç kontrolü yönetmek. doz zamanlaması tedavi farmakokinetik profili bağlı olacaktır (adım 2.1). Bir müdahale tedavisi bir örneği şöyle sağlanmıştır yer almış tümörlerin (Şekil 3) farelerde, haftada 3 gün ip enjekte edilmiştir. Tümör yükünü izlemek için terapötik tedavi dönemleri süresince endoskopik muayene haftalık gerçekleştirin. Genel olarak, terapötik tedavi 4 haftalık bir amacı, tedavi yanıtı için yeterlidir. Tedavi kesilmesinden sonra farelerin bir kohort da tümör nüks için endoskopi ile izlenebilir. CO2 zehirlenmesi fareler öldürülür ve haftada 45 veya tedavi 4 haftalık takip döneminde kolon ve tümörlerin biyokimyasal ve / veya histolojik analizi için doku toplanır. > 5 ve_title ". Endoskopik Sınavları endoskopi ekipmanı, standart prosedürlere 16'ya göre monte edilmelidir. Sterilize ve% 70 etanol ya da bir anti-bakteriyel madde ile endoskop probu temizleyin. Videolar gibi iMovie gibi bir dizüstü veya masaüstü bilgisayar ve standart medya yazılımı kullanılarak kaydedilebilir. Standart bir bilgisayar monitörü, yerine tıbbi sınıf monitör, endoskopi prosedürü (Şekil 4) sırasında kolon görselleştirmek için yeterlidir. 0,2-0,4 litre / dakika arasında bir oranda eş zamanlı olarak% 100 O2 içinde% 3 izofluran ile bir bölme içinde 5-6 fare grupları anestezisi. Ayak tutam tarafından onaylandıktan anestezi uygulanır farelerde, sonra; izofluran düzeyleri bakımından% 0.5-2 kadar değiştirilmelidir. Odasından tek bir fare çıkarın ve bir burun-koni güvenli olarak kafa ile ventral tarafı yukarı yerleştirin. Tam anestezi izlenmelidir ve s, böylece arka bacaklar ayarlanabilir olmalıdırfare arkasında dışarı tretched. Kuruluğunu önlemek için farelerin gözleri bir veteriner merhem yerleştirin. Açıkça anüs ortaya çıkarmak için alt omurga karşılayan fare kuyruğu tutun. Su, bir cam kaba sert endoskop kılıfı kaydedin ve her seferinde küçük bir kabarcık boşaltılması için hava akışını ayarlamak. Hava akımı kolon şişirmek için izin verecektir. Hava akımı çok güçlü ise, hava fare mideye basılacaktır. Hiçbir ek yağlama gerekmez. Dikkatle rektum içine sert endoskop kılıfını takın. Genellikle, endoskop fareler eğrileri kolon işaret ve sert endoskop için erişilebilir olmadığı 3 cm kadar eklenebilir. Endoskopi prosedürler sırasında ortak bir zorluk nedeniyle dışkı ile kolon lümeni erişim bloke olduğunu. Yavaşça feca etrafında endoskop manevra dikkatli dışkılama teşvik etmek prosedürden önce farelerin karın masaj, ya da bu kaçınınİşlem sırasında l meselesi. Peristaltizmin ayrıca kolon kas rahatlatır kadar sırasında endoskop pozisyonda tutulmalıdır, oluşabilir. Endoskopi işleminin herhangi bir aşamasında video kaydı başlatın. Hastalık puanlama prosedürü sırasında deneyimli bir asistan tarafından kaydedilen veya video dosyalarını daha sonraki bir zaman noktasında olabilir. Endoskopik sınav sonrasında, kendi kafesine fareler dönün ve anestezi kurtarma sırasında onları izlemek. Hayvanlar izofluran yönetmek burun konisi çıkarıldıktan sonra 2 dakika içinde genellikle uyanık ve hareketli. Bu işlemler deneyimli bir bilim adamı tarafından gerçekleştirilen emin olun. Her endoskopi işlemi fare başına yaklaşık 2 dakika sürecektir. 6. Hastalık Puanlama (I) değişiklikleri belgeleri kolit Şiddeti murin endoskopik İndeksi (MEICS) 16, şeffaflık ile gösterilen kolon duvar kalınlığı için video skoru, kolit izlemek, (Ii) ila (iv) bir zerre moda içinde mevcut ülser ve yenilenme bölgeleri, (v) yatakları (Şekil 5a) fibrin ile gösterilen kanama dışkı kıvamı, (iii) kan damar bütünlüğü ve varlığı. Tümör yükü izlemek için, tümör insidansı ve boyutu için videolar puan. Tümör boyutu tümör 16 (Şekil 5b) tarafından işgal kolon lümen çapına göre belirlenir. Bu, tek bir fare için her iki kolit ve tümör puanlama parametreleri kullanmak yaygındır. Endoskopi, tek tek tümörler ve kolon mukozası sağlığını kullanarak tek bir hayvanda yeni terapötiklerin başarısı için okumasını sağlayan bir süre boyunca izlenebilir. (İsteğe bağlı) Hareketsiz görüntüleri temsili rakamlar (Şekil 6) nesil için videolar elde edilebilir.

Representative Results

Ağırlık kaybı rutin farelerin genel sağlık izlemek için kullanılır kolit ile ilişkili hastalık izlemek için standart bir parametre olarak kullanılır. Hayvanlar DSS içeren su tatbik ederken, genellikle kendi ağırlığı korumak ve normal içme suyu iade edildiğinde, yalnızca gevşek ağırlık başlar. Kabul edilebilir kilo kaybı parametreleri kurumun hayvan etik kurul göre kurulmuş olmalıdır. Uzun süreli ishal ile bağlantılı su kaybını önlemek püre rutin olarak kullanmak için (besin peletleri püresi ve içme suyu ile karıştırılmış), normal içme suyuna ilave olarak bir protein shake ile takviye edilmiştir. Alternatif bir anestezi, ketamin / ksilazin ve benzeri maddeler kullanılabilir ve böylece, eğer izofluran ekipman mevcut değildir. Nedeniyle endoskop sert doğası, bu işlemler sadece fare kolon en uzak 3 cm görselleştirme için izin verir. Ile Yeni endoskoplar (esneklik ve floresan dahil) ek yetenekleri deney ihtiyaçlarına bağlı olarak mevcuttur. DSS zararlı etkileri öncelikle orta kolonda görülen hafif patoloji ile farelerin distal kolon, sınırlı olduğundan Ancak, sert endoskop bireysel farelerin mukozal sağlığı izleme engel değildir. Akut DDS ile indüklenen kolit profilaktik tedavisi için bir protokol açıklar, ancak bu protokol kolayca müdahale tedavi stratejileri test etmek için modifiye edilebilir. epitel hasarı ve kolit hafifletmek üzere tasarlanmış bir ilacın etkinliği, tek tek farelerde uzunlamasına izlenir ve tanımlanan puanlama parametreleri (Şekil 5) göre belirlenebilir. Bu deneysel protokol sırasında belirli zaman noktalarında farelerin seçilmesini gerektiren geleneksel deney tasarımları avantajlıdır, ve zaman içinde bir muameleye hastalık yanıtının karakterizasyonu izin vermez. t "> insanlarda yapılan klinik çalışmalar bireysel hasta tedavilere yanıt ne kadar farklı tümörler önemli değişkenlik sermiştir. Burada anlatılan prosedürler genel tümör yükü, hem de kurs boyunca bireysel tümörlerin tedavi yanıtını izlemek için bir araç sağlar Bir deneyin. Kanser modelleri için özetlenen müdahale protokolleri dikkate tümör başlaması üzerine bir tedavinin etkilerini yapmayız dikkate almak önemlidir. profilaktik protokoller, tümörler endoskopi ile görünür hale ne zaman önce verilen tedavi ile, Bu bilgileri elde etmek için gereklidir. Burada belirtilen protokoller ilerlemesi üzerindeki terapötik etkileri hakkında bilgi, tümörlerin (tümör boyutu ile ölçülen). Tümör regresyonu de görülebilir tümörler sayısında bir azalma ile belirtilir. g "/> Şekil 1:., Akut kolon hasarının bir model uygulamanın profilaktik bir uygulama tedavinin etkinliğini izleme (a) 'deneysel protokol baştan tamamlanma 8 gün gerektirir. Tedavi profilaktik tedavileri için Gün 1 (b) tatbik edilmektedir. DSS Deneysel protokol 3. gün içme suyu (c) 'de temin edilmiştir. Endoskop hayvanlarda hastalık ilerlemesini izlemek için (d) 'de gerçekleştirilir. Önerilen zamannoktaları aşılamadan Gün 5 ve 8 (hastalık yükünü belirlemek için) Gün 0 (işlenmemiş) ve Gün 2 (sağlık izleme) içerir. Deney, vahşi tip fare (f) zaman içerisinde hastalık artar dizisinde Gün 8 (e) sabah sonlandırılır. Şekil 2: Bir Model o müdahale tedavisinin etkinliğini izlemef kanser kolit ile ilişkili. (a) Deneysel protokol baştan tamamlanması 72 gün gerektirir. (B) 'Terapötik müdahale tedaviler için Gün 46 kurulan tümörleri olan farelere tatbik edilmektedir. AOM (c) 1. günde enjekte edilir ve DSS 8. Endoskop (d) 'hayvanlarda hastalık ilerlemesini izlemek için gerçekleştirilir gününde başlayarak, deney protokolü üç döngü boyunca içme suyu sağlanmıştır. Önerilen zamannoktaları aşılamadan (grup hayvanlara tümör yüküne göre) Gün (işlenmemiş) 0, Gün 20 (sağlık kontrolü) ve Gün 40 içermektedir. Endoskop hastalığı sonuçlarını izlemek için bir terapötik tedavi boyunca haftada bir gerçekleştirilir. Deney (e) itibaren gün 40 artar bir vahşi tip fare (f) tümör yükü de Gün 72. sabah sonlandırılır. <img alt="Şekil 3,"src = "/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg" /> Şekil 3:. Spontan kolorektal kanser modelinde müdahale tedavinin etkinliğini izleme deneysel protokol, (a) baştan tamamlanma> 50 hafta gerekir. (B) 'Terapötik müdahale tedavileri için kurulan tümörleri olan farelere tatbik edilmektedir. AOM (c) deney protokolü boyunca ve bundan haftalarca sonra birbirini takip eden 6 enjeksiyonlar için 1. günde enjekte edilmiştir. Endoskop (d), hayvanlarda, hastalığın ilerlemesini izlemek için gerçekleştirilir. Önerilen zamannoktaları aşılamadan iki haftada orada (tümör yükünü kurmak için) sonra Günü 0 (işlenmemiş) ve Hafta 8 (tümör izleme) ve içerir. Endoskop tedavi açısından izlemek için tedavi süresi boyunca haftada bir gerçekleştirilir. Deney (e) itibaren Hafta 40 artar bir vahşi tip fare (f) tümör yükü içinde Hafta 50 içinde sona ermektedir. </p> Şekil 4:. Donatımı set-up ekipman bireysel adet endoskopik birimi için deneysel set-up (a), belirtti. tek tek bileşenlerin katı endoskop (b) göstermektedir. Ölçek çubuğu = 2.5 cm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5:. Endoskopi ile Puanlama hastalığı parametreleri bir taslak (a) Kolit Şiddeti Murin Endoskopik Endeksi (MEICS) olarak. Bireysel tümör puanlama parametreleri bir taslak (b).es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Şekil 6: Temsilcisi tedavi tedaviler Temsilcisi kilo kaybı, endoskopik görüntüleri ve puanları:. (A) Akut mukozal hasar DSS-kaynaklı (b) sıralı takip geliştirilen AOM / DSS protokolü takip geliştirilen Tümörler (c) Tümörler.. AOM protokolü. Grup başına n = 3 fare. * P <0.05, *** p <0.001 (Student T-testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Farelerde barsak hastalığı patolojisi güvenilir ve yeniden üretilebilir bir indüksiyon hatları yöntemler açıklanmaktadır üç protokol de. Rutin endoskopik izleme ve burada özetlenen müdahale stratejileri ile kombine edildiğinde, bu protokoller terapötik etkinliği içine güçlü klinik öncesi fikir verecektir. Bizim laboratuvarlar rutin tedavilerin yeni ^10,23,24 başarısını izlemek için bu protokollerin hepsi kullanın.

Bir klinik öncesi hayvan modeli seçerek yeni tedavi ajanlarının test zaman düşünceler vardır. Bu insan hastalığı için model alaka ve terapötik hedefin önerilen eylem tümör mikro katkısını içermektedir. Burada oluşturulan bağırsak hastalığı modellerinde terapötik müdahale için üç protokolleri sağlar. Bu modeller tekrarlanabilir ve hastalık oluşturmak için reaktiflerin teslim yönetmek kolaydır. Önemlisi, modeller son derece ilgili olanBirden yüzleri ve kolit başlangıç ve tümör başlaması ve ilerlemesi aşamalarına. Araştırmacılar ölçüde ²⁵ değişebilir DSS ve / veya AOM tarafından uyarılan hastalık yatkınlık gibi, dikkate deney tasarlama kullanılan fare suşlarının genetik geçmişini almalıdır. Buna ek olarak, farklı mikrobiyal topluluklar bakteriler tarafından metabolize edilir AOM bağlamında farklı metabolik kapasitelerine sahip olabilir. Biz tek bir deneyde (ticari satıcılardan dahil) farklı hayvan tesisleri içine doğmuş farelerin farklı kohortlarını kullanarak karşı dikkatli olun. Benzer şekilde, farklı tesislerden kullanılan farelerde farklı mikroflora farklı konak yanıtları epitel bariyer hasarı ^11-kaynaklı DSS için ortaya çıkarabilir. Ayrıca, (örneğin, RNA saflaştırma için) doku uygun analiz, daha sonraki moleküler analizde ^26,27 etkileyecek ters transkriptazı inhibe etmek için, DSS yeteneği yana dikkate alınmalıdır.

<p class = "jove_content"> Fare endoskopi art arda bireysel fare hastalığın başlamasını ve ilerlemesini izlemek için bir kesme kenarı tekniğidir. video kaydetmek ve hareketsiz görüntüleri ayıklamak için yeteneği birden hastalık parametreleri ve tümörlerin kolay izleme imkanı sağlamaktadır. Hayvan refahı geliştirmeye ek olarak, endoskopik izleme de geleneksel hastalık sonucu izlemek için farklı zaman noktalarında itlaf edildi deneysel farelerin birden kohortlarda, ihtiyacını azaltır. MEICS puanlama sistemi histopatolojik analiz için bir alternatifi değildir, ancak alternatif canlı farelerde hayvan sağlığı ve mukozal hasarı izlemek anlamına gelir sağlar. Fare endoskopi özel bir laboratuar tekniği ve tüm işlemler farelerin uygun manipülasyon ve kullanım sağlamak için, yanı sıra hastalık puanlama için kullanılan görüntülerin tutarlı kaliteyi sağlamak için eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. Nitelikli kişisel elinde, biz endoskopi tumo az veya hiç hasar uyardığını buldukintra-tümöral kanamaya neden olur rs. Bu ilk tümör yükünü belirlemek için bir yol sağlar ve terapötik ilaç uygulamasından önce benzer tümör yüklerin hayvanların grup kohortlarda için bize izin verir çünkü özetlenen tedavi protokolleri için, biz, endoskopi çok avantajlıdır düşünün. Farelerin Sıralı izleme zamanında başarısız deneyler sonlandırma seçeneği ile, erken yeni tedavilerin etkinliğini belirlemek için araştırmacılar sağlar.

Iltihaplı bağırsak hastalığı ve kolorektal kanserler önceden daha iyi anlaşılması olarak, tedavi için yeni hedeflerin belirlenmesi edilecektir. Uygun hayvan modelleri en umut verici yeni tedaviler klinik çalışmalarda doğru hareket sağlamak için ayrılmaz olacaktır.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000)	MP Biochemicals	160110	Requires batch testing.
Azoxymethane	Sigma	A5486-100MG	Requires batch testing.
Vanilla Protein Shake	N/A	N/A	Available from hospital pharmacies.
Isoflourane	PPC	M60303	This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% Ethanol	N/A	N/A	Standard lab reagent.

Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam	Karl Storz	20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump	Karl Storz	20134001
HOPKINS straight Forward Telescope	Karl Storz	64301AA
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm)	Kalr Stroz	61029C
Fubre Optic Light Cable	Kalr Stroz	69495ND
Computer and media player software	MAC, imovies
Scale	Any		Any scale suitable for weighing mice.

Referanslar

Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
Rose, W. A., Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).

Etiketler

Non-invasive Assessment Therapeutic Efficacy Intestinal Pathologies Endoscopic Imaging Live Mice Animal Models Inflammatory Bowel Disease Colorectal Cancer Pre-clinical Studies Acute Mucosal Damage Chronic Colitis Colitis-associated Colon Cancer Sporadic Colorectal Cancer Serial Endoscopic Examination Therapeutic Response Health Monitoring

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Ernst, M., Preaudet, A., Putoczki, T. Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice. J. Vis. Exp. (97), e52383, doi:10.3791/52383 (2015).