生きたマウスのシリアル内視鏡イメージングを使用して、腸の異常のための新しい治療の有効性の非侵襲的評価

医学研究動物倫理委員会のウォルターとエリザ·ホール研究所は、これらのプロトコルに記載された手順のそれぞれを承認した。 実験マウスの作製少なくとも4性別の実験的コホートを構成するには、飼育さと同じ特定の病原体を含まない（SPF）動物施設/部屋に収容し、オートクレーブ食料と水で提供されて6〜8週齢のC57BL / 6マウス（ ハツカネズミ ） が一致した。雌マウスの使用は、異なる株からのマウスの共同住宅を可能にボックス番号を制限し、ケージにケージのばらつきを減少させる。 そのマウスを確認し3.0ミリメートルの直径の内視鏡検査シースを使用して、内視鏡検査の手続きを可能にするために、年齢の少なくとも6週間である。 腸内細菌叢に関連した変動を低減するために、同じラックに格納されているケージから、同じ遺伝的背景のマウス、および可能な場合に使用します。動物施設との間の細菌叢の変動が考慮WHEに入れなければならないnは各実験22に対する適切な対照マウスと遺伝子型を決定する。 耳/つま先の切り抜き、タトゥー、または類似のことでマークマウスが簡単に識別できるようにする。 ベースライン実験的な重みを決定するために、0日目にマウスを計量。 内視鏡検査を実行し、ベースライン結腸の表現型を記録するために、0日目にマウスの（第5節参照）。 上皮損傷と急性大腸炎モデル2.前臨床試験治療剤の溶液を調製するテストされる。強制経口（PO）で配信治療のため、100μlに最大音量の解決策を準備する。腹腔内（IP）注射によって送達治療のために、200μlの最大音量の解決策を準備する。 注：長期間にわたって繰り返さipまたは経口薬剤投与は、変更されたマウスの動作が発生することができます。長期の不快感を避けるには、ip注射部位を交互に。経口投与のために、AUTOCをマウスに与える経管栄養の手順で不利な関連性を最小限にするために「御馳走」としてヒマワリの種をlaved。 1日目に、目的の治療（ステップ2.1で調製）と、適切な車両制御を管理する。 （ 図6A）提供される例では、組換えヒト5μgの（相対湿度）iInterleukin（IL）-11タンパク質を、200μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、腹腔内投与したテストされている治 ​​療薬のために確立された薬物動態プロファイルに依存するであろう、行政のタイミングと頻度を決定します。 図1は 、実験の過程で一日二回の腹腔内注射を使用して予防的治療の概要を説明します。 便の硬さと血液の存在を含め、監視し、毎日、各マウスの重量を量る。治療の日には、計量を繰り返し取り扱いによって引き起こされるマウスにストレスを最小限に抑えるために、治療薬の投与と一致する必要があります。 </lI> 3日目に、2.5％（2.5グラム/ 100ミリリットル）日常動物施設によってマウスに提供飲料水中のDSS溶液を調製。約5ミリリットル/ DSS溶液のマウス/日の実験のために必要とされる。動物施設の環境温度が変動した場合にDSS水の消費量が変化してもよい。 注：DSSが刺激性で、MSDSの指示に従って処理する必要があります。 5連続日間きれいな水ボトルのマウスを自由に新鮮なDSSを提供します。 5日目の夜には、マッシュポテト食品ペレットと小さなペトリ皿（100グラムの食物ペレット/ 10グラムのプロテインシェイク/ 10ミリリットル水）に提供されるタンパク質のサプリメントに加えて、通常の飲料水を提供する。これは脱水を防ぎ、厳しい減量を最小限に抑えることを支援します。 CO 2中毒によりマウスを安楽死させると8日目の朝に、その後の組織学的分析のための組織を収集し、またはマウスは以上3つのCのための≥15％の重量損失が発生した場合最初のいずれか早いonsecutive日、。 注：（w / v）の動物施設とDSSのバッチの微生物叢に応じて1から4パーセントの間でDSSの投与量を調整します。適切なDSSの投与量および回避バッチ間の変動を確立するために、ルーチンバッチ試験を行う。適切な投与量は、体重減少（元の重量の15％より大きくない）に基づいており、大腸組織病理を確認すべきである。 慢性大腸炎や大腸炎関連癌モデル3.前臨床試験慢性大腸炎モデルの場合はステップ3.7から始める。 大腸炎関連癌（CAC）モデルの場合は、1日目に、10mg / kgの（w / w）のアゾキシメタン（AOM、250μL、腹腔内）で各マウスを注入する。 注：AOMは発がん性物質であるとMSDSの指示に従って処理する必要があります。 AOMのストック溶液は、10mg / mlのアリコートとして調製し、-20℃で保存する。注射の日に、AOMのストック溶液を、1mg / mで解凍し、希釈するPBS中のL。 AOMストック溶液の凍結融解の繰り返しは避けるべきである。 AOM用量は8-12 mg / kgを間に調整することができる。ルーチンバッチ試験は、バッチ間の変動によるマウスに毒性を回避するために、適切なAOM投与量を確立するために必要とされる。 1-7日間、AOM投与重みが安定する、以下、この理由のため、重量の監視は、その糞便中に細胞傷害性代謝産物を排出します処理動物を避けるために日1-7中に省略することができる。 7日目、すべての寝具は、細胞毒性の手順に従って変更する必要がある。寝具の変更が完了したら、彼らはもはや細胞傷害性代謝産物を排出されませんように、動物は、もはや、細胞毒性取り扱い手順を必要としません。 8日目に、2.5％（2.5グラム/ 100ml）で（ステップ2.5で説明したように）DSS溶液を調製し、マウスを自由に与える。 実験を通して毎日のマウスを計量し、病気の兆候を監視し、フリルFUを含むR、ハンチング、血便と縮小の動き。 13日目に、DSS溶液を除去し、28日8-28日まで通常の飲料水をマウスに与える慢性大腸炎/ CACプロトコルの1「サイクル」を構成している。 日13-28、にマウスを通常の飲用水が与えられたときに、マッシュ食品ペレットを有するマウス、小さなペトリ皿（100gの食物ペレット/ 10gのプロテインシェイク/水10ml）に設けられたタンパク質サプリメントを提供する。これは脱水を防ぎ、厳しい減量を最小限に抑えることを支援します。 注：マウスはDSS消費の一貫性を確保するために、DSSを含む飲料水を受信して​​いるときマッシュ中のタンパク質サプリメントが提供されるべきではない。 20日目に（第5節参照）個々のマウスの健康状態を監視するために第二の内視鏡検査を行う。 日に29リピートDSSサイクル（サイクル2：2.5％（V）DSSデイズ34から50の間、日29-33、通常の飲料水の間に提供/ w）である。 40日目THIを行う個々のマウスの健康状態を監視し、腫瘍量を決定するための内視鏡検査をRD（セクション5を参照）。 全く腫瘍が40日内視鏡検査によって表示されていない場合は、日数50から72（2.5％（V）DSSデイズ56から72の間、日50-55、通常の飲料水の間に提供/ wのサイクル3）上の第三のDSSサイクルを開始。一般的に、腫瘍は40日目から見えるので、DSSの第3サイクルを省くことができる。 腫瘍は内視鏡検査によって目に見えるようになると、各マウスに内視鏡的腫瘍スコアを割り当てる（ セクション5を参照）と同じようなベースラインの腫瘍負担とコホートに個々のマウスを割り当てる。 42日（または時腫瘍が見える）で、治療化合物または関連する車両制御を管理する（2.2節を参照してください）​​。投与量のタイミングは、治療薬の薬物動態プロファイルに依存するであろう。介入治療の例が提供され、確立された腫瘍（ 図2）を有するマウスに週三回腹腔内注射。 Eを実行します腫瘍負荷を監視するための治療処置の期間にわたって週1回ndoscopic試験。一般に、治療的処置の4週間客観治療反応を観察するのに十分である。治療の中止後に、マウスのコホートは、腫瘍の再発のために内視鏡検査によりモニターすることができる。 CO 2中毒によるマウスを安楽死させるとマウスは以上の3日間連続≥15％の減量を経験するとき、または、いずれか早い方の日72日の朝、生化学的および/ ​​または組織学的分析のために組織を集める。 散発性結腸直腸癌モデルにおける4.前臨床試験 1日目に、10mg / kgのAOM（ステップ3.2参照）で各マウスの腹腔内注入する。 AOM用量は8-12 mg / kgを間に調整することができる。ルーチンバッチ試験は、バッチ間の変動によるマウスに毒性を回避するために、適切なAOM投与量を確立するために必要とされる。 各週の最初の日に注射を繰り返します次の5週間（ 図3）。マウスは、全体の6週間の細胞毒性安全手順に従って処理してください。 繰り返し処理によって引き起こされるマウスに苦痛を最小限にするためにAOM注射の日に、各マウスを計量。 注：AOMは発がん性物質であるとMSDSの指示に従って処理する必要があります。 すべての動物は、このプロトコルに必要AOMの腹腔内注射の6週間の細胞毒性安全手順に従って処理してください。 週8中、新興の腫瘍のために監視するために内視鏡検査を行う（第5節参照）。腫瘍が見えるようになるまで、内視鏡検査では隔週行われるべきである。一般的に、野生型C57BL / 6動物はAOMの最初の投与後、約40週間までに腫瘍の開発を始める。 腫瘍は内視鏡検査によって目に見えるようになると、各マウスに内視鏡的腫瘍スコアを割り当てる（セクション5を参照）と類似したとのコホートへの個々のマウスを割り当て治療的処置の開始前に腫瘍の負担。 週40（または時腫瘍が最初に表示されている）の間に、治療化合物または関連する車両制御を管理する。 投与量のタイミングは、治療の薬物動態プロファイルに依存することになる（ステップ2.1参照）。介入治療の例が提供され、確立された腫瘍（ 図3）を有するマウスに週3回腹腔内注射。 腫瘍負荷を監視するための治療の治療期間の間、内視鏡検査を毎週実行します。一般に、治療的処置の4週間客観治療反応のために十分である。治療中止後、マウスのコホートは、腫瘍再発のための内視鏡検査によりモニターすることができる。 CO 2中毒によりマウスを安楽死させると週45の間、生化学的および/ ​​またはコロンと腫瘍の組織学的分析のための組織を収集し、または治療の4週間後。 ve_title "> 5。内視鏡検査内視鏡検査機器は、標準的な手順16に従って実装してください。 70％エタノールまたは抗細菌性潤滑剤を内視鏡プローブを滅菌し、きれい。 ビデオは、iMovieのように、ラップトップまたはデスクトップコンピュータおよび標準メディアソフトウェアを使用して記録することができる。標準的なコンピュータのモニタではなく、医療グレードのモニター、内視鏡検査手順（ 図4）の間にコロンを可視化するのに十分である。 0.2 L /分の速度で同時に100％O 2中の3％イソフルランを有するチャンバ内に5~6匹のマウスの群を麻酔。マウスは、つま先のピンチによって確認され、麻酔をかけた後、イソフルランレベルはメンテナンスのために0.5から2パーセントに変更する必要があります。 チャンバーから個々のマウスを外し、鼻コーンに固定その頭でそれ腹側を上に配置します。全身麻酔は、監視されるべきであり、それらが複数あるように後ろ足を調整すべきであるマウスの後ろに出tretched。 乾燥を防ぐために、マウスの眼に獣医軟膏を置きます。 それは明らかに肛門を明らかにするために下部脊椎を満たしているマウスの尾を持ってください。水のビーカーに硬性内視鏡シースを挿入し、一度に一つの小さな気泡の放出を可能にするために空気の流れを調整します。 空気の流れは、コロンが膨張するように許可されます。気流が強すぎると、空気は、マウスの胃にポンピングされる。追加給油は必要ありません。 慎重に直腸内に硬性内視鏡シースを挿入します。一般的に、内視鏡は、マウス曲線にコロンをその時点で3センチ、まで挿入し、硬性内視鏡にアクセスすることはできませんすることができます。 内視鏡検査手順の間に一般的な難しさが原因糞便に大腸の内腔へのアクセスの遮断である。優しく排便を奨励する前に手順にマウスの腹のマッサージ、または慎重にFECA周り内視鏡を操作することで、これを避ける手順中のL状物質。蠕動は、大腸の筋肉組織が弛緩するまで内視鏡を位置に保持されるべき時に、も発生することがあります。 内視鏡検査手順の任意の段階で録画を開始する。疾患スコアは、処置中に経験豊富なアシスタントによって記録、またはビデオファイルから、後の時点ですることができる。 内視鏡検査の後、彼らのケージにマウスを返し、麻酔からの回復中にそれらを監視。動物は、イソフルランを投与ノーズコーンから除去した後2分以内に、一般的に目を覚まし、モバイルである。 これらの手順は、経験豊富な科学者によって行われていることを確認します。各内視鏡検査の手順は、マウス当たり約2分かかります。 6.病スコアリング （i）の変化を文書大腸炎重症度のマウス内視鏡指数（MEICS）16、透明性によって示される結腸壁の厚さのためにビデオをスコア、大腸炎を監視するには（ii）の便の硬さ、（iii）は、血管の完全性とが存在することを、粒状形で存在するが、（v）のフィブリン沈着（ 図5a）で示さ出血こと再生の（iv）の潰瘍および領域。 腫瘍負荷を監視するには、腫瘍の発生率とサイズのビデオをスコア。腫瘍サイズは、腫瘍16（ 図5b）によって占有結腸内腔の直径によって決定される。これは、単一のマウス用炎および腫瘍の両方のスコアリングパラメータを使用することが一般的である。内視鏡検査、個々の腫瘍および結腸粘膜の健康を使用すると、単一の動物において新しい治療の成功のための読み出しを提供し、経時的にモニターすることができる。 （オプションの）静止画像が代表図形（ 図6）を生成するためにビデオから抽出することができる。