新的治疗肠道病变的疗效，使用活体小鼠的串行内镜成像的非侵入性评估

医学研究动物伦理委员会的沃尔特伊丽莎研究所厅批准每一个在这些协议中描述的过程。 1.准备实验小鼠构成的至少4性别实验队列匹配6-8周龄C57BL / 6小鼠（M.家鼠 ），它们孕育和容纳在相同的特定的无病原体（SPF）的动物设施/室和设置有蒸压食物和水。使用雌性小鼠将允许共壳体小鼠从不同的线路，限制框号，以及降低笼到笼的变化。 确保小鼠是至少6周龄，使用3.0毫米直径的内窥镜护套内窥镜程序。 使用的小鼠相同的遗传背景，并且在可能的情况，从存储在同一机架，以减少与肠道菌群的变化相关联的笼中。在动物设施之间菌群变化应当考虑到磨片Ñ ​​确定适当的对照小鼠和基因型每个实验22。 马克小鼠耳/趾剪报，纹身，或类似的允许，便于识别。 称重在第0天的小鼠，以确定基线实验权重。 进行胃镜检查（见第5）小鼠第0天，记录基线结肠表型。 2，临床前试验中的上皮损伤和急性结肠炎型号制备的治疗剂的溶液，以进行测试。对于通过口服管饲法（PO）递送治疗剂，制备溶液，以100微升的最大体积。通过腹膜内（IP）注射递送治疗剂，制备溶液，以200微升的最大体积。 注：在长时间重复IP或口服给药可能导致改变鼠标的行为。交替腹腔注射部位，以避免长时间的不适。对于口服给药，提供小鼠autoclaved葵花籽作为一个'治疗'，以减少与灌胃过程中的不良联想。 在第1天，施用的利息（步骤2.1的方法制备）和适当的载体对照的治疗。在提供的例子中（ 图6A），5微克重组人（rh）下iInterleukin素（IL）-11的蛋白质溶于200微升磷酸盐缓冲盐水（PBS），并施用IP 确定施用，这将依赖于建立该正被测试的治疗试剂的药物动力学分布的时间和频率。 图1概括了使用每天两次腹腔注射在实验的过程中预防性治疗。 监控，包括粪便稠度和血液的存在，并每日称重每只小鼠。在治疗的日子里，称量应与治疗药物的给药重合，以减少应力所引起的反复操作时的小鼠。 </l我> 在第3天，制备2.5％（2.5克/ 100毫升）中常规地由动物设施提供给小鼠的饮用水的DSS溶液。大约5毫升/小鼠/的DSS溶液一天所需的实验。如果动物设施的环境温度波动的DSS水的消耗可能会改变。 注：DSS是具有刺激性，并应按照MSDS的指令来进行处理。 提供新鲜DSS的小鼠自由采食清水瓶连续5天。在5日的晚上，提供正常的饮用水除泥状食物颗粒和小皮氏培养皿（100克食物颗粒/ 10克蛋白质摇/ 10毫升的水）提供的蛋白质补充。这可以防止脱水，并协助最大限度地减少重症减肥。 安乐死小鼠二氧化碳中毒和收集组织进行后续组织学分析的第8天，或早晨，当小鼠经历≥15％减重超过三Consecutive天，以先到为准。 注：调整之间1-4％的DSS剂量（重量/体积）根据动物设施的菌群和批次的DSS。进行，常规批量测试，以建立相应的DSS剂量和规避批次到批次的变化。合适的剂量应根据瘦身（原始重量的不大于15％），并确认结肠炎组织病理学。 3.临床前试验在慢性结肠炎或结肠炎相关的癌症模型对于慢性结肠炎模型开始从步骤3.7。 对于结肠炎相关癌症（CAC）的模式，在第1天，以10毫克/公斤（W / W）氧化偶氮甲烷（AOM，250微升，IP）注射各小鼠。 注：AOM是一种致癌物质，并应按照MSDS的指令来进行处理。 AOM的储备溶液制备为10毫克/毫升的等分试样并储存在-20℃。对注射的当天，AOM的原液解冻，并稀释至1毫克/米升的PBS。应避免反复冷冻和AOM的原液解冻。 AOM的剂量可以8-12毫克/公斤之间调整。常规批量测试需要建立相应的AOM剂量以规避毒性小鼠由于批次到批次的变化。 在第1-7天以下的AOM施用权重将是稳定的，因为这个原因重量监控可以第1-7天期间被省略，以避免处理的动物，这将排泄的代谢物的细胞毒性在其粪便。 在第7天全部寝具需要下列细胞毒性程序来改变。一旦被褥变化完成后，该动物不再需要的细胞毒性的处理程序，因为它们将不再被排泄细胞毒性代谢物。 在第8天，制备2.5％（2.5克/ 100毫升）的DSS溶液（如在步骤2.5中描述），并提供给小鼠自由进食。 每天称量小鼠在整个实验过程和监测疾病的迹象，包括竖起福R，拱起，便血和减少运动。 第13天，取出DSS解决方案，并提供小鼠与正常饮水，直到28日8-28天构成慢性结肠炎/ CAC协议的一个“周期”。 在13-28天，当小鼠给予正常饮水，提供小鼠捣碎食物颗粒和小皮氏培养皿（100克食物颗粒/ 10克蛋白质摇/ 10毫升的水）提供的蛋白质补充。这可以防止脱水，并协助最大限度地减少重症减肥。 注意：当小鼠接​​受DSS含饮用水，以确保DSS消费一致性蛋白补充剂醪不应该提供的。 在20日进行的第二次内镜检查来监察个别鼠标的健康（见第5）。 在29天的重复周期DSS（周期2：2.5％（重量/体积）DSS天34-50天期间29-33和正常饮水时提供）。 在40日​​进行的THIRD内镜检查来监察个别鼠标的健康，并确定肿瘤负荷（见第5）。 如果没有肿瘤是可见的内镜40日，开始在天50-72第三DSS周期（周期3：2.5％（重量/体积）DSS天56-72天期间50-55和正常饮水时提供）。通常，肿瘤是由40天可见，因此，决策支持系统的第三周期可以省略。 一旦肿瘤变得可见通过内镜检查，分配给每个鼠标内窥镜肿瘤分数（见第5章 ），并指派个别小鼠同伙有类似的基线肿瘤负荷。 第42天（或当肿瘤是可见的），管理治疗化合物或相关的车辆控制（参见2.2节）。剂量的定时将依赖于治疗剂的药代动力学曲线。干预治疗的一个例子的小鼠腹腔注射每周三次，提供建立的肿瘤（ 图2）。 执行电子ndoscopic考试每周一次以上的治疗性治疗的持续时间来监测肿瘤负荷。通常，4周治疗性治疗是足够观察客观治疗反应。以下戒烟治疗，小鼠的队列也可以通过内窥镜对肿瘤复发监测。 安乐死小鼠二氧化碳中毒和或当小鼠经历≥15％减重连续三天以上，以先到者为准收集组织进行生化和/或组织学分析72日的早晨。 4.临床前试验的散发性结直肠癌型号在第1天，用10mg / kg的急性中耳炎（参见步骤3.2）注入每只小鼠的IP。 AOM的剂量可以8-12毫克/公斤之间调整。常规批量测试需要建立相应的AOM剂量以规避毒性小鼠由于批次到批次的变化。 重复注射，每周的第一天对于以下5个周（ 图3）。小鼠应根据细胞毒性安全程序为整个6周处理。 权衡对AOM注射当天每只小鼠以减少痛苦而引起反复操作时的小鼠。 注：AOM是一种致癌物质，并应按照MSDS的指令来进行处理。 所有的动物应根据细胞毒性安全程序的6周需要这种协议AOM腹腔注射处理。 在8周进行内镜检查，以监测为新兴的肿瘤（见第5）。内镜检查应进行每两个星期，直到肿瘤变得可见。通常，野生型C57BL / 6动物开始的AOM的初始给药后发展的肿瘤约40周。 一旦肿瘤变得可见通过内镜检查，分配给每个鼠标内窥镜肿瘤分数（见第5章），并指派个别小鼠类似队列之前治疗的肿瘤开始负担。 在40周（或当肿瘤是第一个可见的），管理治疗化合物或相关车辆控制。 剂量的定时将依赖于治疗剂的药代动力学特性（参见步骤2.1）。干预治疗的一个例子的小鼠腹腔注射每周3次，用被设置已建立的肿瘤（ 图3）。 用于治疗性治疗周期的持续时间来监测肿瘤负荷进行内窥镜检查每周。通常，4周治疗性治疗是足够的客观治疗反应。治疗后停止，小鼠的队列也可以通过内窥镜肿瘤复发监测。 安乐死的小鼠用CO 2中毒并在45周，或以下4周治疗收集组织用于结肠和肿瘤的生化和/或组织学分析。 ve_title“> 5。内镜检查该内窥镜设备应当根据标准程序16进行组装。 消毒和清洁，用70％的乙醇或抗细菌润滑剂的内窥镜探针。 画可以使用笔记本或台式计算机和标准的媒体软件，如iMovie中被记录。一个标准的计算机监视器，而不是医用级监视器，足以显现内镜程序（ 图4）在结肠。 麻醉5-6只小鼠的组同时与在100％O 2 3％异氟醚的腔室以0.2-0.4升/分的速率。一旦麻醉的小鼠，它是由脚趾捏确认;在异氟烷水平应改变以0.5-2％以进行维护。 从室内除去个别的鼠标，并把它腹侧了它的头固定在鼻锥。充分麻醉应监视和后腿应调整，使它们有stretched淘汰落后的鼠标。 放置在老鼠的眼睛兽医药膏，以防止干燥。 持在那里它满足下脊椎清楚地揭示了肛门鼠标的尾部。插入硬性内窥镜鞘成水的烧杯中，并调整气流，以允许其中一个小气泡的释放的时间。 气流将允许结肠膨胀。如果气流太强，空气将被泵入小鼠的胃。没有额外的润滑是必需的。 小心地将硬性内窥镜套入直肠。通常，内窥镜能插入多达3厘米，在这一点，结肠小鼠曲线和不能访问的硬性内窥镜。 在内窥镜检查程序的常见困难是获得结肠的内腔堵塞因粪便物。通过之前的程序轻轻按摩小鼠腹部鼓励排便，或精心操纵内窥镜周围的FECA避免这种在手术过程中升的问题。蠕动，也可能发生，在此期间，内窥镜应在适当的位置被保持到结肠肌肉松弛。 启动视频录制在内窥镜程序的任何阶段。病的得分可以由有经验的助手在手术期间被记录，或从视频文件稍后的时间点。 继内镜检查，返回老鼠笼子，并从麻醉恢复过程中监视他们。动物一般都是清醒和移动在2分钟之后删除所管理的异氟醚鼻锥。 确保这些程序是由经验丰富的科学家进行的。每个内窥镜程序将每只小鼠约2分钟。 6.疾病评分并监控结肠炎，得分视频的小鼠内镜结肠炎的严重程度（MEICS）结肠壁由透明表示的厚度指数16，其（i）中记载的改变，（ⅱ）大便稠度，（ⅲ）血管完整性和存在，（iv）对出现在粒状时尚溃疡和再生区，（v）的出血表示由纤维蛋白沉积（ 图5a）。 监测肿瘤的负担，进球视频用于肿瘤的发病率和大小。肿瘤大小通过由肿瘤16（ 图5b）所占据的结肠腔的直径来决定。它通常使用既结肠炎和肿瘤评分参数为单个鼠标。用内窥镜，个体肿瘤和结肠黏膜的健康可随时间被监测，提供一个读出的新的治疗剂的成功在单个动物。 （可选）静止图像可以从视频中提取的一代的代表性人物（ 图6）。