We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
El cáncer colorrectal (CCR) es la 4ª causa más común del cáncer en todo el mundo 1. A pesar de los significativos avances en nuestra comprensión de la base familiar de esta enfermedad, la predisposición genética sólo contribuye a ~ 20% de los casos de CCR 2. El resto se atribuye a numerosos factores extrínsecos y ambientales, incluyendo la inflamación crónica. En los seres humanos, la relación entre la inflamación crónica y el cáncer de colon es evidente en la colitis ulcerosa (CU) de los pacientes, que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de colon colitis asociada (CAC), en función de la duración, extensión y gravedad de la enfermedad inflamatoria 3 -5. De acuerdo con ello, nuevas terapias se encuentran en desarrollo para controlar la respuesta inmune y la producción asociada de factores de crecimiento por promover el microambiente tumoral inflamatoria 6-8. No es un requisito creciente para modelos animales pre-clínicos apropiados para caracterizar la eficacia terapéutica deestos fármacos contra el desarrollo y progresión de la enfermedad.
Los modelos de ratón han demostrado de manera inequívoca que el microambiente inflamatoria contribuye a la progresión de la CRC, incluso en ausencia de inflamación abierta 9,10. Estos modelos incluyen el uso de las sales de sodio de sulfato de dextrano polisacárido (DSS), proporcionada en el agua de bebida de los ratones, al modelo de lesión epitelial y la enfermedad intestinal inflamatoria aguda y crónica (IBD) 11,12. Aunque el mecanismo por el cual DSS induce daño de la mucosa y colitis no se comprende completamente, algunos estudios sugieren que DSS inhibe las actividades celulares de la transcriptasa inversa ribonucleasa y dentro de las células, o promueve la formación de complejos de nano-lípido que se fusionan con la membrana de colon que conduce a daño epitelial 13,14. Las modificaciones al modelo DSS estándar también han proporcionado una información valiosa sobre los mecanismos por los cuales las células epiteliales del colon mantienen la homeostasis del tejido y regula respuesta inmune de la mucosa finales 15.
La administración intraperitoneal de azoximetano (AOM) solo, o en combinación con DSS, proporciona un modelo para examinar la interacción entre las mutaciones somáticas en la mucosa epitelial y el microambiente inflamatorio y del estroma 16,17. AOM es un metabolito del carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (DMH) que no resulten directamente en mutaciones en el ADN. En lugar de ello, AOM se hidroliza para metilazoximetanol (MAM) por la isoforma del citocromo CYP2E1 en el hígado, donde MAM se conjuga con ácido glucurónico y luego transportado a la intestino a través de las secreciones biliares 18. Se cree que la β-glucuronidasa bacteriana contribuye a la degradación de MAM resultante en la alquilación de ADN y la acumulación de mutaciones en células epiteliales 19. La mayoría de los tumores de colon inducida por AOM-albergan mutaciones sin sentido en el gen que codifica la β-catenina, lo que hace la proteína resistente a degradati proteasomalen, lo que resulta en la activación aberrante de la vía Wnt de señalización canónica 20. Cuando la actividad de la OMA se combina con el daño de la mucosa inducida por DSS, la herida resultante respuesta de curación crea un microambiente propicio para el crecimiento y la expansión del epitelio mutado. En una variación de este modelo, la administración repetitiva de AOM solo durante un período de varias semanas puede ser utilizado para modelar cáncer colorrectal esporádico, en ausencia de colitis inducida por DSS 10,17. Estos dos modelos gratuitos proporcionan parámetros experimentales para estudiar CAC y esporádica CRC, respectivamente, ambos de los cuales están asociados con un microambiente tumoral pro-inflamatoria 10.
El uso de la endoscopia en serie en ratones fue iniciado por Becker y sus colegas 21, y permite la monitorización longitudinal de la colitis y la progresión tumoral. Aquí proporcionamos tres protocolos pre-clínicos basados en daño de la mucosa inducida por DSS y / o AOM mediada tumor de inducción para inducir reproducible patologías del colon específicos. El primer protocolo describe la inducción de daño de la mucosa aguda en respuesta a la administración de DSS para provocar muchas de las características histopatológicas de la EII. El segundo protocolo se basa en tres ciclos consecutivos de administración de DSS para imitar los brotes de inflamación observada comúnmente en pacientes con EII, y puede llevarse a cabo en conjunción con las mutaciones inducidas por AOM. El protocolo final se basa en mutaciones esporádicas epiteliales inducida por AOM. Para cada uno de estos protocolos, nos expandimos en los procedimientos estándar pertinentes para incluir métodos de intervención profilácticas y terapéuticas que hemos desarrollado para controlar la eficacia de nuevos fármacos.
Los tres protocolos que se describen los métodos de contorno de la inducción fiable y reproducible de patología de la enfermedad del colon en ratones. Cuando se combina con las estrategias de intervención esbozadas aquí vigilancia endoscópica de rutina y, estos protocolos proporcionarán poderosa visión pre-clínico sobre la eficacia de la terapéutica. Nuestros laboratorios utilizan rutinariamente todos estos protocolos para monitorear el éxito de nuevos productos terapéuticos 10,23,24.
Hay un número de consideraciones al elegir un modelo animal pre-clínicos para probar nuevas terapias. Estos incluyen pertinencia del modelo de la enfermedad humana, y la contribución del microambiente tumoral a la acción propuesta de la diana terapéutica. Aquí proporcionamos tres protocolos para la intervención terapéutica en modelos de enfermedades intestinales establecidos. Estos modelos son reproducibles y la entrega de reactivos para inducir la enfermedad es fácil de manejar. Es importante destacar que los modelos son muy relevantesa múltiples facetas y etapas de inicio colitis, y de la iniciación y progresión tumoral. Los investigadores deben tener en cuenta los antecedentes genéticos de las cepas de ratones utilizados en el diseño de experimentos, como la susceptibilidad a la enfermedad inducida por DSS y / o AOM puede variar considerablemente 25. Además, diferentes comunidades microbianas pueden tener diferentes capacidades metabólicas en el contexto de la OMA, que se metaboliza por las bacterias. Advertimos contra el uso de diferentes cohortes de ratones que nacieron en diferentes instalaciones de los animales (incluidos los proveedores comerciales) en un solo experimento. Del mismo modo, los diferentes microflora en ratones utilizados de diferentes instalaciones puede provocar diferentes respuestas del huésped a DSS-indujeron daños barrera epitelial 11. Además, el análisis apropiado de tejido (por ejemplo la purificación de ARN) también debe ser considerado, ya que la capacidad de DSS para inhibir la transcriptasa inversa tendrá un impacto en el análisis molecular posterior 26,27.
<p class = "jove_content"> Mouse endoscopia es una técnica de vanguardia para controlar repetidamente inicio de la enfermedad y la progresión en un ratón individual. La posibilidad de grabar vídeos y extraer imágenes fijas permite un fácil monitoreo de múltiples parámetros de la enfermedad y los tumores. Además de mejorar el bienestar de los animales, la vigilancia endoscópica también reduce la necesidad de múltiples cohortes de ratones experimentales, que tradicionalmente fueron sacrificados en diferentes puntos de tiempo para realizar un seguimiento de evolución de la enfermedad. El sistema de puntuación MEICS no es un sustituto para el análisis histopatológico, pero proporciona un medio alternativo para controlar daños a la salud de los animales y de la mucosa en ratones vivos. Ratón endoscopia es una técnica de laboratorio especializado, y todos los procedimientos deben ser realizados por personal capacitado para garantizar la manipulación y el manejo adecuado de los ratones, así como para proporcionar una calidad constante en las imágenes utilizadas para la puntuación enfermedad. En las manos de personal cualificado, hemos encontrado que la endoscopia induce poco o ningún daño a la tumors que causarían sangrado intra-tumoral. Para los protocolos terapéuticos descritos, consideramos endoscopia muy ventajosa, ya que proporciona una manera de determinar la carga inicial del tumor, y nos permite cohortes grupo de animales con cargas tumorales similares antes de la administración de un fármaco terapéutico. Monitorización secuencial de los ratones permite a los investigadores a determinar la eficacia de nuevas terapias desde el principio, con la opción de terminar los experimentos fallidos de manera oportuna.A medida que nuestra comprensión de la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal antelación, se identificarán nuevos objetivos para la terapia. Modelos animales apropiados serán integrales a asegurar que las nuevas terapias más prometedoras se mueven hacia los ensayos clínicos.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | MAC, imovies | ||
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |