Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings
Özet
Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Abstract
Сочетание локальной фиксации записи из двух (или более) синаптически связанных нейронов (парные записи) в острых мозг срезов препаратов с одновременным заполнением внутриклеточного biocytin позволяет коррелированную анализ их структурных и функциональных свойств. С помощью этого метода можно выявить и охарактеризовать как до, так и постсинаптические нейроны их морфологии и электрофизиологические рисунком ответа. Парные записи позволяют изучать образцы подключения между этими нейронами, а также свойства химической и электрической передачи синаптической. Здесь мы даем шаг за шагом описание процедур, необходимых для получения надежных парные записи вместе с оптимального восстановления нейронов морфологии. Мы расскажем, как пары нейронов, соединенных через химических синапсов или щелевых контактов указаны в мозг срезов препаратов. Мы будем общих чертах, как нейроны восстанавливаются, чтобы получить их 3D морфологию dendritIC и аксонов домена и, как синаптические контакты были выявлены и локализованы. Мы также обсудим предостережения и ограничения в паре технологии записи, в частности те, которые связаны с дендритных и аксонов укорочения в процессе подготовки срезах мозга, потому что они сильно влиять на показатели подключения. Тем не менее, из-за универсальности в паре подхода записи она останется ценным инструментом для характеристики различных аспектов синаптической передачи в определенных нейронных микросхем в головном мозге.
Introduction
Нервные микросхемы между двумя синаптически связанных нейронов являются строительными блоками крупномасштабных сетей в мозге и являются базовыми элементами синаптической обработки информации. Предпосылкой для характеристики таких нейронных микросхем, чтобы знать морфологию и функциональные свойства как пре- и постсинаптических нейронов партнеров, тип синаптической связи (ов) и свою структуру и функциональные механизма. Тем не менее, во многих исследованиях синаптических соединений, по меньшей мере один из нейронов в микросхеме не хорошо охарактеризованы. Это связано с относительно неспецифических протоколов стимуляции, часто используемых в исследованиях синаптической связи. Таким образом, структурные и функциональные свойства пресинаптического нейрона либо не определены вообще или лишь в весьма малой степени (то есть, выражение маркерных белков и т.д.). Парные записи в сочетании с внутриклеточным окрашиванием маркерами суч как biocytin, neurobiotin или флуоресцентных красителей лучше всего подходит для изучения малых нейронных микросхем. Этот метод позволяет исследовать множество структурных и функциональных параметров морфологически определены синаптической связи, в то же время.
Так называемые «унитарные» моносинаптические связи между двумя нейронами были исследованы в обоих корковых и подкорковых областях мозга 1-10 с использованием острых срезов препаратов. Первоначально острые микроэлектродов были использованы в этих опытах; Через записи патч зажим был использован для того, чтобы получить записи синаптических сигналов с более низким уровнем шума и улучшенной временным разрешением.
Значительный технический прогресс был использование инфракрасного дифференциального интерференционного контраста (ИК-ДИК) оптики 11-14, микроскопические техники, что значительно улучшило видимость и идентификации нейронов в срезе мозга, так что это стало возможным тО получить записи с визуальной идентификации синаптических связей 15-17. В общем, парных записи делаются в острых срезов препаратов; только очень немногие публикации доступны отчетности записи с синаптически связанных нейронов в естественных условиях 18-20.
Наиболее важным преимуществом парных записей является то, что функциональные характеристики могут быть объединены с морфологического анализа как на световой и электронной микроскопическом уровне (см, например., 7,16,21). После гистохимическим обработки, дендритных и аксонального морфологии синаптически связанных нейронов пары прослеживается. Затем можно количественно морфологические особенности, такие как длина, пространственной плотности, ориентации, ветвления и т.д. Эти параметры можно затем обеспечивают основу для объективной классификации конкретного синаптической связи. Кроме того, в отличие от большинства других методов, используемых для изучения нейронных connectiВиты, в паре записи также позволяет идентифицировать синаптических контактов унитарных синаптических связей. Это может быть сделано непосредственно с использованием комбинации световой и электронной микроскопии 16,21-27 или с помощью визуализации кальция 28,29 дендритных шипиков. Тем не менее, с последнего подхода только возбуждающим, но не ингибирующие соединения могут быть изучены, как это требуется приток кальция через постсинаптических рецепторов каналов.
В дополнение к детальному анализу синаптической передачи в определенном нейронных микросхем в паре записей также позволит исследовать синаптических правил пластичности 30,31 или – в сочетании с агонистом / антагонистом применения – модуляции синаптической передачи с помощью медиаторов, таких как ацетилхолин, 32 и аденозина 33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Парные записи с синаптически в сочетании возбуждающих и / или тормозных нейронов являются очень гибким подходом к изучению нейронных микросхем. Мало того, что этот подход позволяет оценить связь синаптическую между типами нейронов, но и позволяет определить функциональные характерис…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
Referanslar
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Nörobilim. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
