Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
Alta definizione Fourier Transform Infrared (FT-IR) di imaging spettroscopico è un approccio emergente per ottenere immagini dettagliate che sono associate informazioni biochimiche. Imaging FT-IR di tessuto si basa sul principio che diverse regioni del medio infrarosso sono assorbiti dai diversi legami chimici (ad esempio, C = O, CH, NH) all'interno delle cellule o tessuti che possono poi essere legati alla presenza e alla composizione di biomolecole (ad esempio, lipidi, DNA, glicogeno, proteine, collagene). In un'immagine FT-IR, ogni pixel all'interno dell'immagine comprende un intero infrarossi (IR) dello spettro che può dare informazioni sullo stato biochimico delle cellule che possono essere sfruttati per tipo cellulare o malattia tipo di classificazione. In questo articolo, vi mostriamo: come ottenere immagini a infrarossi da tessuti umani mediante un sistema di FT-IR, come modificare la strumentazione esistente per consentire la funzionalità di imaging ad alta definizione, e come visualizzare le immagini FT-IR. Abbiamo poi presentiamo alcune applicazioni di FT-IRper patologia utilizzando il fegato ei reni come esempi. Imaging FT-IR detiene applicazioni interessanti nel fornire un percorso romanzo di ottenere informazioni biochimiche dalle cellule e tessuti in un percorso che non generi completamente libero-label verso dando nuova visione cambiamenti biomolecolari come parte di processi di malattia. Inoltre, queste informazioni biochimiche può potenzialmente consentire un'analisi obiettiva e automatizzato di alcuni aspetti della diagnosi della malattia.
Spettroscopia IR è stato uno strumento di analisi disponibili in qualche forma dal 1930; tuttavia, è stato solo nell'ultimo decennio che l'area di imaging dei tessuti con FT-IR è esploso. I progressi nella FT-IR per l'imaging dei tessuti sono stati guidati in gran parte da tre sviluppi fondamentali: 1) aumento della velocità di acquisizione dei dati a causa della disponibilità di grandi Focal Plane Array (FPA) rilevatori che in genere hanno migliaia di IR rivelatori sensibili 1 , 2, 2) lo sviluppo di algoritmi di elaborazione avanzate e la potenza di calcolo per gestire grandi quantità di dati iperspettrali set 3, e 3) la modellazione di sistemi di imaging FT-IR per massimizzare la risoluzione spaziale di 4,5. Ci sono stati numerosi di alta qualità e molto ampi articoli rivedere il campo della spettroscopia FT-IR recentemente 6-16, oltre a un documento di natura protocolli che illustra le fasi per ottenere punto spettri o le mappe da tessuti 17. In questo articolo, ci concentreremo sulla protocol di ottenere immagini di tessuti utilizzando un rivelatore FPA 128 x 128 in un sistema FT-IR modificato con capacità ad alta definizione.
Imaging FT-IR è stato a lungo suggerito uno strumento potenzialmente auspicabile per l'imaging cellulare e tissutale dovuta alla capacità di ottenere immagini in cui ogni pixel ha una ricchezza di informazioni biochimiche. Imaging FT-IR si basa sul principio che diverse biomolecole in un campione saranno quantitativamente assorbire diverse regioni del medio infrarosso; questo consente la derivazione di un 'impronta digitale biochimico'. Questa impronta digitale era stato dimostrato in molti studi di modificare tra i diversi tipi di cellule e stati di malattia. Diversamente pratica patologia convenzionale quando macchie e marcatori immunoistochimici devono essere utilizzati per la visualizzazione e identificare i tipi cellulari e strutture tissutali che vengono utilizzati per guidare opzioni diagnosi e trattamento, le immagini da FT-IR sono formate sulla base biochimica intrinseca del tessuto. Il techniq attualeue di tessuto colorazione per la diagnosi è in termini di tempo, distruttivo, laborioso, e richiede competenze personale di patologo, mentre FT-IR offre la possibilità di rendere questo processo rapido, non distruttivo, altamente automatizzato, e più obiettivo. Inoltre, FT-IR fornisce un nuovo percorso per ottenere ulteriori informazioni biochimiche che potrebbe non essere prontamente accessibili usando tecniche di colorazione convenzionali.
Uno dei progressi più interessanti degli ultimi anni è stata la disponibilità di approcci di imaging ad alta risoluzione che può ora permettere per la visualizzazione e la caratterizzazione di tipi di cellule e strutture del tessuto che sono fondamentali per una completa diagnosi della malattia. Una di queste tecniche è Attenuated Total Reflectance (ATR) FT-IR che incorpora un obiettivo a immersione solido (SIL) di un alto indice di rifrazione, che consente per imaging ad alta risoluzione 18, con molti studi molto interessanti che mostra le sue applicazioni 19-25. Inoltre, wcome ha recentemente dimostrato che la risoluzione spaziale maggiore associato a immagini ATR può permettere per la visualizzazione e la classificazione delle cellule endoteliali e mioepiteliali nel tessuto mammario che costituiscono una componente chiave della diagnosi di cancro al seno 26. Mentre l'imaging ATR è molto utile, questa tecnica richiede la SIL di entrare in contatto con il tessuto per formare immagini FT-IR; Pertanto, il suo uso è un po 'limitato per patologia dei tessuti in cui le grandi regioni di tessuti devono essere rapidamente ripreso.
Un secondo approccio è stata dimostrata accoppiando un obiettivo ad alto ingrandimento un sistema FT-IR esistente che utilizza un sincrotrone come fonte luminosa di IR, è possibile illuminare completamente un FPA e l'immagine con una dimensione di pixel effettiva di 0,54 x 0,54 micron. Questo ha permesso a noi di visualizzare strutture chiave in seno e della prostata tessuti che non erano risolvibili con sistemi convenzionali FT-IR 4. Mentre questi aumenti drammatici in immagine IR resolutio spazialen fosse emozionante, il suo uso è rimasto limitato a causa di richiedere un sincrotrone. Successivamente, un sistema ottimale creata che potrebbe anche consentire funzionalità di imaging ad alta definizione con una dimensione di pixel 1,1 x 1,1 micron, senza il requisito di una sorgente di sincrotrone bensì utilizzando una sorgente IR Globar tradizionale 5. In questo articolo, vi mostriamo come modificare un sistema di imaging esistente commerciale FT-IR per consentire la diffrazione IR limitato l'imaging dei tessuti con un segnale accettabile per rumore con obiettivi multipli IR (15X, 36X, e 74x). Il formato di pixel effettivi con i tre obiettivi è 5.5 x 5.5 micron (15X), 2,2 x 2,2 micron (36X) e 1.1 x 1.1 micron (74x). Abbiamo poi diamo alcuni esempi dell'importanza dei guadagni in risoluzione spaziale per la rilevazione della malattia in fegato e reni biopsie 27.
FT-IR è una modalità emergente gratis-label di imaging biochimica di sezioni di tessuto, con la possibilità di avere un ruolo importante nel migliorare l'attuale standard di diagnosi in patologia. Il gold standard attuale per la patologia richiede tessuti essere sottoposte a biopsia, fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati più volte, e colorati con diversi macchie. Un patologo altamente qualificato deve valutare soggettivamente visivamente la struttura del tessuto e la morfologia cellulare per stabilire una diagnosi. Qui vi mostriamo come raccogliere immagini a infrarossi ad alta risoluzione dello stesso tipo di sezioni e discutere alcuni degli approcci computazionali per esaminare le differenze chimiche tra i tipi di cellule e stati di malattia.
I passaggi critici all'interno di questo protocollo sono di assicurare che i tessuti sono molto attentamente concentrati e che il sistema è ben calibrato per garantire dati spettroscopici di altissima qualità. La cura durante l'installazione del sistema è particolarmente Criti cal quando si lavora con gli obiettivi ad alto ingrandimento. Per facilitare la risoluzione dei problemi, il seguente elenco descrive alcuni dei potenziali difficoltà incontrate;
Problema: bassa intensità IR quando l'imaging in riflessione. Soluzione: Verificare l'orientamento diapositiva IR come il rivestimento riflettente può essere dalla parte sbagliata della diapositiva.
Problema: segnale basso / rosso segnale di avvertimento in Lancer controllo. Soluzione: rilevatori raffreddare con LN2. È richiesto azoto liquido per i rivelatori FPA per funzionare e richiede periodicamente di essere ricaricato.
Problema: Velocity errori errore / movimento. Soluzione: reimpostare spettrometro e ridurre le vibrazioni. Vibrazioni causeranno lo specchio in movimento nel interferometro essere disturbato.
Problema: picchi vapore acqueo in dati. Soluzione: Aumentare spurgo sul sistema e proteggere campione d'aria.
Problema: centerburst valido. Soluzione: Trova centerburst di nuovo.
e_content "> Problema:. bassa differenza di flusso nella trasmissione, anche se concentrato. Soluzione Regolare condensatore basso Ciò si verifica quando la luce IR non viene focalizzato in un punto sul campione.In questo lavoro, ci siamo concentrati su come acquisire immagini ad alta definizione a infrarossi dei tessuti sia in trasmissione o in modalità trasflettanza. La natura dell'imaging FT-IR, è che ci sono molteplici modifiche che possono essere fatte per l'acquisizione dati, ad esempio, il tipo di substrato, tecniche di fissazione, spessore del campione, risoluzione spettrale, interferometro velocità specchio ecc L'effetto di questi parametri ha stato discusso in ampi dettagli recentemente 4,5,17,51.
Ci sono un certo numero di modifiche che possono essere apportate al sistema di imaging compreso l'imaging in modalità ATR 10,24,26 e utilizzando approcci termici nanoscala 52,53 per consentire imaging ad alta risoluzione IR. La limitazione principale con alta risoluzione di imaging IR è che la TIUESTIONI devono essere accuratamente preparati e abbastanza sottili per IR per passare (in genere 4 di spessore micron). Inoltre, la trasmissione e riflettanza FT-IR di imaging richiede i campioni ad essere asciutta a causa della assorbanza IR dall'acqua. Tuttavia, imaging FT-IR ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche, in quanto può immagine molto rapidamente grandi aree di tessuto mentre derivanti ricca e dettagliata informazioni biochimiche. Altre tecniche simili che derivano informazioni biochimiche in un modo libero-label includono la spettroscopia Raman, ma il tempo di acquisizione dei dati è molto più lento di acquisire immagini. Approcci di imaging Nuovo Raman stanno emergendo tra cui diffusione stimolata Raman (SRS) e Coherent Antistokes Raman (CARS); Tuttavia, essi hanno accesso gamma spettrale limitato o di imaging singola frequenza.
I progressi nella velocità di acquisizione dei dati, risoluzione spaziale, e la disponibilità di approcci computazionali sono stati di enorme valore nel fare FT-IR imagzione un approccio più fattibile per la traduzione come un nuovo strumento di imaging in patologia. I recenti progressi nella risoluzione spaziale sono stati particolarmente importanti per la patologia dei tessuti a causa di tipi di cellule non siano risolvibili con sistemi di imaging FT-IR convenzionali. Il recente articolo di Reddy et al. mostrato come modellare un sistema ideale per ottenere la risoluzione spaziale ottimale di un sistema di imaging FT-IR 5. L'esempio tessuto renale presentato in questo documento dimostra l'importanza di risoluzioni spaziali elevate per estrarre informazioni biochimiche dalle strutture glomerulari (Figura 3 e Figura 5). In futuro, nuovi progressi in Quantum Cascade Laser come molto luminose sorgenti di luce IR 54-57, 3D immagini spettrali 58, e innovazioni nel campo delle tecnologie su scala nanometrica IR 52,53,59,60 detengono nuovi entusiasmanti percorsi di ricerca che possono avere enormi implicazioni per il futuro di imaging dei tessuti.
<p class = "jove_content"> Abbiamo presentato esempi di applicazioni in fegato e malattie renali in cui vi è la necessità di informazioni biochimiche aggiuntivo che può essere di valore diagnostico. La Spectral Patologia Lab presso il Dipartimento di Patologia presso la University of Illinois a Chicago si concentra sulla traduzione delle tecnologie di imaging IR per migliorare la diagnosi della malattia e migliorare la previsione della prognosi del paziente. Imaging FT-IR può superare alcuni dei limiti attuali di pratica patologia che richiedono informazioni quantitative e obiettiva. In particolare, il lavoro futuro si concentra sull'identificazione aree in pratica patologia attuale, in cui le tecniche attuali non riescono a fornire un adeguato sensibilità diagnostica o fornire informazioni limitate. Esiste una chiara necessità di migliorare la pratica attuale di patologia e verso dare più informazioni al patologo sullo stato di malattia del paziente, che può essere realizzabile utilizzando ad alta definizione di immagini FT-IR.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |