3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

イメージング用1. 3D細胞培養と準備培養に適切な細胞株、 すなわち、HCT116結腸癌細胞株、二次元、単層培養した。 一般的には数日かかる50〜70％の集密度まで、5％CO 2インキュベーターでマッコイの5A培地+ 10％ウシ胎児血清を含むT-25フラスコにHCT 116細胞を増殖させる。 0.25％トリプシン-EDTA溶液で細胞を放出し、細胞密度および生存率をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞の一部をカウントする。 カウントした後、適当なウェル6000細胞/播種密度は、30,000細胞/ mlを達成するために完全培地で細胞を希釈する。 2.アガロース被覆96ウェルプレートを準備します 50ミリリットルコニカルチューブ内の標準のメディアの10ミリリットル（メディアでの1.5％アガロース溶液）10にアガロースの0.19グラムを追加します。穏やかに混合することによって取り込みを確認してください。水浴中でアガロースオートクレーブ20分間。 アガロース+媒体混合物の50μlをフラット60中央ウェル中に吸引する、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート培養プレート底。プレートの周縁部におけるウェルはわずかに高い蒸発速度を有するように、200μlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の代わりに、これらのエッジにアガロースを加える。 アガロース混合物は、内側のウェルに添加された後に冷却するために脇にプレートをセット〜37 細胞の添加の前にCを°。 三次元培養を3シードとなりがち注：複数またはより少ない細胞が関与培養の要件に応じて播種することができるが、それはこれらの条件は、培養の10〜14日後に直径約1mmの三次元細胞培養構造をもたらすことが判明した（データは示していない） 。 アガロース被覆に（〜6000細胞を含むように希釈された）適切な細胞溶液200μlを追加します。96ウェルプレート。プレートをカバーし、細胞増殖のために37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター内で設定。 細胞媒体ごとに48時間の最小値を変更するか、またはメディアが表示されたときに色を変更すること。 慎重にアガロースの下にある（2日目までに肉眼で見える）小三次元細胞培養の周囲から古いメディアを吸引することによって、メディアを変更します。三次元細胞培養の上に静かに新鮮な培地200μlを追加します。 これらのメディアの変更時には（オプションステップ）は、テストのための化学療法剤または他の薬剤を追加します。完全なメディアとの最終濃度になるように選択薬を希釈し、各ウェルに必要な200μlを添加する。 三次元細胞培養物は、直径約1mmになるまで、光学顕微鏡で3次元細胞培養増殖をモニターする。 4.収穫の3D細胞培養優しくアガロースベッドから3D細胞培養を削除するには2ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。 <李は>優しく待っている24ウェルプレートに約1mlのPBSにそれらをピペッティングすることによりPBSで3次元細胞培養物を洗ってください。 転送は、タンパク質または代謝産物を抽出するための遠心管に、血清学的ピペットを介して三次元細胞培養物を収穫し、または画像化用途のためにスライスを支援するために、切断媒体に埋め込む。 ゼラチン5.埋め込みの3D細胞培養高純度の水で〜175 mg / mlのゼラチンの溶液を準備（18MΩ推奨）。22,23、激しくゼラチンを混ぜる。粘性および操作が困難になって解決策を守ってください。溶液が透明と吸引することが容易となるまで〜60℃の水浴中でゼラチンを含むコニカルチューブを配置し、暖かい。 注：温かいゼラチン溶液は、それが冷えると急速に硬化するため、急速に凍結する前に、次の手順をすべて実行。 それを加熱した後、細胞培養フードに直ちにゼラチンを取る。 BEAにゼラチンでチューブを維持約60で予熱水とケル ゼラチン溶液の硬化を避けるためにC°。 2ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、24平底プレートのウェル中に温かいゼラチン溶液0.6mlを堆積させる。このボリュームは、薄層の下側をカバーするのに十分である。穏やかに直ちに3D構造を破裂を避けるために異なるの2mlピペットを用いてゼラチン層の上に三次元細胞培養物を堆積させる。 注：ケアは、ゼラチンにPBSを配置していないこの段階で注意しなければならない。このような場合は、しかし、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。 三次元細胞培養物をゼラチン層の表面上に配置された後の培養物の位置を乱さないように、慎重に、三次元細胞培養上温かいゼラチン混合物の別の0.6ミリリットルをピペット。第2層が配置された後、-80℃でゼラチン包埋3D細胞培養を凍結。 6.スライスと解凍マウント番目質量分析イメージング用の電子ゼラチン包埋3D細胞培養冷凍庫から3D細胞培養物を含む24ウェルプレートを外します。ピンセットやメスでは、ウェルの側面ダウン優しくスライドするまで、あなたの手からの熱とプレートの底を温める。 スムーズにセンターを解凍せずにゼラチンを解放、ピンセットやメスをスライドさせます。クライオスタットサポートに一滴の水を取り、支援にゼラチンディスクを接着するためにこれを使用する。 ゼラチン中に埋め込まれた三次元細胞培養物を-30℃でスライスに最も適している。使用前に70％エタノールクライオスタットブレードとガラスを清掃してください。ブレードの鈍化を防ぐために、ブレードまたは各3D細胞培養 – ゼラチンディスクの新しいブレードの別の部分を使用してください。 3D細胞培養物が見えるようになるまで、クライオスタットを用いて、優しく余分なゼラチンをオフに直面している。 この時点で、ゆっくりと12〜16ミクロンのセクションでスムーズな動きで3D細胞培養物をスライス。 注：スライスへの重要な要因は、ブレードにガラスの距離、ブレード角度、クライオスタットの温度、及び支持体上のディスクの角度を含むので、これらのすべては、一貫性のある結果を保証するためにチェックする必要があります。 慎重にスライスを解凍し、適切に標識されたインジウムチタン酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライド上にマウントし、デシケーターに保管してください。最高品質のために可能な限り迅速にスライスを使用してください。 7.マトリックスアプリケーションおよびMALDIイメージング用サンプル調製 MALDIイメージングに先立ち、適切なマトリックスとスライスを準備する。 小分子の分析のために、何回の洗浄工程は、一般的に必要とされない。無傷のタンパク質の検出のために、そのような信号をマスクする可能性脂質などの小分子を除去するために冷100％アセトン、カルノア液、または70％/ 95％イソプロパノールでスライスを洗浄し、24 – 26 静かに時を超えない30秒間洗浄します。しないすべてのスライスを乱す。 0.1％TFAと、有機溶媒と水の溶液中でマトリックスを準備する。そのようなαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）などの小分子は、60％ACNを使用し、40％H 2 O：0.1％TFA（10 mg / mlで）。タンパク質検出のためのそのようなシナピン酸（30 mg / ml）でのように、同じ溶媒溶液を使用する。シナピン酸の最適な溶解度のため、TFAを添加する前に、アセトニトリル中で最初に溶解する：H 2 O溶液。他のマトリックスを適宜用いることができる。 注意：マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっている注目すべきである。小さい結晶は、複数の分子種が検出され、生物学的な違いはなく、マトリックス効果に起因することを可能にし、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 メソッドをhandspottingにより行列を適用します。 MATRの0.5μLを適用する先の細い注射器を使用してください三次元細胞培養スライス上にix溶液とマトリックスが結晶化さ許す。 また、エアブラシメソッドを使用します。マトリックス溶液と商用グレードのエアブラシを埋める。 8〜12インチ離れスライドから噴霧器を保持するスライスで微細な噴霧を目指しています。パス間では、1分間に最高の結晶形成を可能にするためのマトリックスを乾燥させる。エアブラシの10〜20パスまでのマトリクス22の最適な層を製造するために必要とされている。 また、他の場所で詳述さ昇華法を使用しています。25,27 かかわらず行列適用の方法のMALDI-MSI、前の少なくとも30分間デシケーター中で乾燥したスライド25 MALDI-TOFシステムを用いた8 MALDI-MSI分析（ すなわち、オートフレックスIII） 注：このセクションでは、MALDI-TOFイメージング実験のためのパラメータを設定するための指示やアドバイスが含まれています。アドインによってはtrumentメーカーやソフトウェア使用、プロセスが異なる場合があります。 しっかりとイメージにITO被覆されたスライドに付着した3D細胞培養スライスを75ミリメートル×25 mmスライドを保持するために作られ、アダプタのスライドを取り付けます。機器にスライドアダプタをロードします。 問題の質量範囲のための適切な較正標準を選択することにより、MALDI-MSIのための楽器を準備します。小分子の尋問のために、使用されるマトリックス、α-CHCAに対応して検出された信号は、キャリブラントの一つの共通のグループである。タンパク質の分析のために、関心のある質量範囲内の既知のタンパク質標準（ すなわち、ユビキチン、トリプシノーゲン）を選択し、較正物質として3次元細胞培養に隣接してスポットする。メソッド開発を進める前に、機器を校正。 画像化の前に、機器の製造業者が提供するソフトウェアを使用して、選択した質量範囲のためのデータ取得方法を開発する。のための図1と図2を参照してください小分子とタンパク質イメージング。小分子イメージングのために、最高の質量分解能のためのリフレクトロンモードを使用しています。 のm / z 100〜1,000の間と8,000- 25000 メートル/ zの間のタンパク質のための小分子データ取得のための質量範囲を調整します。楽器を持つ可能性が最も高い質量分解能を提供しながら、選択領域を包含するように質量範囲を調整します。 レーザパワー、周波数、較正溶液と近くの「犠牲」の3D細胞培養スライスを用いたレーザーショットとスポットサイズの数を調整する。主計測器制御ソフトウェアでこれらの設定を確認します。 60％の電力、400レーザーショット、超小型スポットサイズ：推奨されるの出発点として、以下の設定を使用してください。これらの設定は、楽器やメソッド間で異なるので、それぞれ特定の楽器のための最高品質のスペクトルを与えるために、機器パラメータを最適化します。調整することができる他のパラメータは、検出器利得、サンプルレート、及び電子利得を含む。 Sイメージングソフトウェアで使用するためには、この方法をaveの（ すなわち 、自動実行方法はFlexImagingがに頼ること）。 注：検出を妨害しないように（再び計測器制御で見つかった）関心の質量範囲以下のイオンを抑制します。 選択した質量範囲のためのタンパク質のデータ取得方法を開発する。上記で概説した同じ手順に従いますが、今回は中〜高質量範囲については、約3 kDaの上、リニア·モードを使用します。 NOTE：設定小分子法のために使用されるものとは異なる。 そのようなブルカーMALDI-TOFシステム用FlexImagingとして機器の製造元から提供イメージングソフトウェアを使用してセットアップ特定のMS機器パラメータ、。 前と保存されて開発された方法を使用して、新しいイメージングファイルとフォルダを作成します。そのようなラスタスポット（ステップ8.3.2または8.3.3にセットアップ）計測器制御方法を設定するサイズ（約200μm〜50μmのデフォルトからの変更）、およびPOSIなどの機器パラメータを選択します三次元細胞培養物を走査するる。 順番に各レーザを移動し、試料上の3適切なティーチポイントを選択します。 「印刷画面」を使用して、MALDI-TOFレーザー制御ソフトウェアからの光学写真を入手します。 注：多くのイメージング·ソフトウェア·プログラムは、スキャナまたはしばしば器具カメラで得られるレーザが配置されている「教示」ソフトウェア、サンプルの光学写真を必要とする。 その後、イメージングソフトウェア（しない計測器制御）からの撮像処理を開始し、各スライスからマススペクトルを取得。特定の領域に局在ほとんどの3D細胞培養全体の質量と他の人を観察します。 9.オプションデータ解析手法ターゲット分析のために、平均スペクトルに質量をクリックすることにより、スペクトルの手分析を行い、または（イメージングソフトウェアが自動的に特定のしきい値を超える質量を選択できるように例えば 、ABピーク）上位20％のしきい値をOVE。品質管理のため、マトリックスピークの分布や平均スペクトルを調べる。 そのようなRやMatlabなどの数学ソフトウェアで抽出されたデータセットを統計分析を実行します。 ASCII形式でエクスポートシングルスペクトル、好みのソフトウェアにロードするための読み取り可能なテキストフ​​ァイル、。 、いくつかの異なるソフトウェアプログラムによって28読み取るためmzML形式のASCII、mzXML、個々のスペクトルに変換する- 31、または分析（.imgの）形式のファイル、MRIのような他のイメージング用途に使用される一般的なフォーマットとしてデータをエクスポート32分析のための2つのオープンソースのオプションはMSiReaderとバイオマップ32,33です。 ファイルは、ソフトウェアによって読み取り可能なフォーマットにエクスポートされると、それぞれのソフトウェアの命令を経由してデータセットをロードします。ロード後、そのようなベースラインの除去および正規化として、取得後の処理を行う。 このデータセットでは、statiがを実行そのようなカスタムスクリプトやMatlabなど18のようなソフトウェアでのアルゴリズムで構築いずれかを使用して、階層的クラスタリングの主成分分析としてsticalトリートメント。