样品制备策略的3D细胞培养模型质谱成像

1. 3D细胞培养和准备成像培养一合适的细胞系， 即，HCT116结肠癌细胞系，在二维，单层培养。 成长的HCT 116细胞中的T-25烧瓶中的McCoy的5A介质，在5％的CO 2培养箱直至50-70％汇合，通常需要几天的时间+ 10％胎牛血清。 释放的细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，并计数使用血球细胞的一部分和台盼蓝染色以检查细胞密度和生存力。 计数后，稀释细胞用完全培养基以达到6000细胞的一个合适的接种密度/孔，或30000个细胞/ ml。 2.准备琼脂糖涂层的96孔板添加0.19克琼脂糖至10ml标准培养基的50ml锥形管中（在介质的1.5％琼脂糖溶液）10。确保纳入轻轻搅拌。高压灭菌琼脂糖在水浴20分钟。 使用多道移液器，吸50微升琼脂糖+媒体混合到平底96孔板培养板的60家中央水井。作为孔在板的外周边缘具有稍高的蒸发率，添加200μl的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）代替琼脂糖这些边缘。 一旦琼脂糖混合物已被添加到所述内孔中，除了设置在板冷却到37〜 °C中的加入细胞前。 3.种子，往往在三维培养注：更多或更少的细胞可以取决于所涉及的文化的要求进行接种，但已经确定，这些条件后10-14天培养物导致在大约1毫米直径的三维细胞培养物的结构（数据未显示） 。 加入200μl适当的细胞溶液（稀释含有〜6000细胞）的琼脂糖涂层96孔板中。覆盖板并在潮湿的培养箱，用5％的CO 2设定在37℃下细胞生长。 改变细胞的媒体至少每48小时，或者出现媒体时，会改变颜色。 通过仔细吸出旧媒体从周围的小三维细胞培养物（可见的肉眼由第2天），在琼脂糖的底部改变介质。加入200微升新鲜培养基轻轻在三维细胞培养物。 （可选步骤），在这些媒体的变化，增加化疗药物或其他药物进行测试。稀的首选药物，以提供完整的媒体的终浓度并添加必要的200μl到每个孔中。 监控三维细胞培养物的生长通过光学显微镜，直到三维细胞培养物大约1毫米的直径。 4.收获的3D细胞培养用2毫升血清吸管从琼脂糖床上轻轻地取下3D细胞培养。 <LI>轻轻吹打成约1毫升PBS在等待24孔板洗净3D细胞培养与PBS。 传输通过血清​​吸管收获3D细胞培养的离心管中的蛋白质或代谢物的提取，或将它们嵌入在切割中，以协助对切片成像应用。 在明胶5.嵌入的3D细胞培养准备〜175毫克/毫升明胶的高纯度水（18MΩ首选），22,23混合明胶大力。观察溶液变得粘稠，难以操作。将含有明胶的锥形管在水浴中在约60℃，温暖，直到溶液变得清晰和容易抽吸。 注：温暖明胶溶液变硬迅速，因为它的冷却，所以冷冻前快速地执行所有以下步骤。 之后将其加热，立即采取明胶到细胞培养罩。保持管明胶在BEAKER用预热的水在约60 °C至避免明胶溶液硬化。 使用2ml的血清吸液管，沉积0.6毫升暖明胶溶液成24平底板的孔中。此体积是足以覆盖一薄层的底部。轻轻沉积立即上使用不同的2毫升吸管，以避免破裂的三维结构中的明胶层的顶部的三维细胞培养物。 注意：必须注意在此阶段不放置的PBS放入明胶。如果发生这种情况，但是，使用的是200微升吸管从明胶的顶部取出PBS中。 后的三维细胞培养物放置在明胶层的表面上，小心地吸取另一个0.6暖明胶混合物在三维细胞培养物的毫升，以便不扰乱培养物的位置。之后的第二层放置，冻结明胶包埋三维细胞培养物在-80℃下。 6切片和解冻日山Ë明胶嵌入式3D细胞培养质谱成像除去24孔板含有从冷冻的三维细胞培养物。暖板与热的底部，从你的手，直到镊子或者手术刀会轻轻滑下井的一侧。 顺畅滑动钳或手术刀，释放明胶没有解冻的中心。取一滴的水，低温恒温器的支持，并以此来坚持明胶盘的支持。 嵌入在明胶三维细胞培养物是最适合于切片在-30℃。清洁低温恒温器叶片和玻璃在使用前用70％的乙醇。使用刀片或每个三维细胞培养物，明胶盘，以防止变钝的刀片的一个新的刀片的不同部分。 使用低温恒温器，轻轻面临关闭多余的明胶，直到3D细胞培养变得可见。 此时慢慢切片3D细胞培养在12-16微米的部分一个平稳的运动。 注：关键因素切片包括玻璃到叶片的距离，刀片角度，低温恒温器的温度，并在盘上的支撑件的角度，因此，所有的这些都必须进行检查，以确保结果的一致性。 小心解冻片和它们安装于氧化铟钛（ITO）涂覆的玻璃载片适当标记，并将其存储在干燥器中。使用切片尽快为最高质量。 对于MALDI成像7.矩阵的应用和样品制备此前MALDI成像，准备切片用适当的矩阵。 对于小分子分析，一般不需要洗涤步骤。为完整蛋白质的检测，用冷100％丙酮的切片，卡诺液，或70％/ 95％的异丙醇，以除去小分子，例如脂类，可能掩盖信号24 – 26 轻轻洗脸不超过30秒的时间。别惊动任何片。 制备基质中有机溶剂和水的溶液，用0.1％的TFA。对于小分子诸如α氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），使用60％的ACN：40％的H 2 O：0.1％TFA（10毫克/毫升）。用于蛋白质检测，例如芥子酸（30毫克/毫升），使用相同的溶剂溶液。用于芥子酸的最佳溶解性，在乙腈首先溶解加入TFA中之前:H 2 O溶液。其它基质可以适当地使用。 注：基质可以与几种不同的方法被应用，但应当注意的一些矩阵已经发现共crystalize与明胶，如阿魏酸，使该样品不能使用。较小的晶体产生更一致的质谱，允许更多的分子种类进行检测，并归因于生理差异，而不是基体效应。 通过handspotting方法应用矩阵。 用细尖的注射器适用0.5微升的MATR的三维细胞培养物切片上IX溶液，并允许矩阵crystalize。 或者，使用喷枪方法。填补了商业级喷枪与基体的解决方案。 持喷雾器8-12英寸远离幻灯片，瞄准精细喷雾在片。在道次之间，允许基质干燥1分钟，以允许最佳晶体形成。可达10-20通行证的喷枪的要求产生矩阵22的一个最佳的层。 或者，使用升华法在其他地方详细说明。25,27 干片在干燥器中至少30分钟前MALDI-MSI，不管矩阵应用的方法的。25 8. MALDI-MSI使用MALDI-TOF系统分析（ 即 AUTOFLEX III） 注：本部分包含的说明和建议的设置参数的MALDI-TOF成像实验。取决于插件trument制造商，所使用的软件，该方法可能会发生变化。 适合于制成以牢固地保持75毫米×25毫米幻灯片将图像附加到ITO涂覆的载玻片的三维细胞培养物的切片的适配器的幻灯片。加载幻灯片适配器插入仪器。 选择的质量范围问题的适当校准标准准备仪器MALDI-MSI。对于小分子的询问，对应于所使用的基质，α-CHCA检测到的信号，是校准物的一个共同的基团。对于蛋白质分析，已知蛋白质标准（ 即，泛素，胰蛋白酶）的质量范围的兴趣被选择和斑点邻近于三维细胞培养物作为校准物。在进行方法开发之前校准仪器。 在成像之前，开发的数据采集方法的选择，用由仪器制造商提供的软件的质量范围。参见图1和2为小分子和蛋白质成像。为小分子成像，使用反射模式的最高质量分辨率。 调整质量范围为小分子的数据采集与100-1,000 米/ z和对之间8,000-25000米/ Z蛋白质。调整质量范围以涵盖所选择的区域，同时提供与仪器的最高质量分辨率成为可能。 调整激光功率，频率，激光射击和光斑尺寸使用校准溶液和附近的“牺牲”三维细胞培养物切片的数量。观察主要仪器控制软件这些设置。使用以下设置为推荐的出发点：60％的功率，400激光枪，超小尺寸光斑。这些设置将整个仪器和方法各不相同，因此优化仪器参数，从而为每个特定仪器的最高质量的光谱。可以调整其它参数包括检测器的增益，采样率，和电子增益。 SAVE这种方法在成像软件的使用（ 即 ，自动执行方法FlexImaging将借鉴）。 注意：下面的质量范围的兴趣抑制离子（在仪器控制再次发现），以便不干扰检测。 开发蛋白质数据采集方法选择的质量范围。按照上面概述的相同的步骤，但对于中到高的质量范围，高于约3 kDa的，采用线性模式。 注：设置将不同于那些用于小分子的方法。 使用由仪器制造商，如FlexImaging对于布鲁克MALDI-TOF系统所提供的成像软件设置特定MS仪器参数。 创建一个新的影像文件和文件夹，使用前制定并保存方法。选择仪器参数，如光栅光斑尺寸（从默认的变化约200微米至50微米），设置仪器控制方法（设置步骤8.3.2或8.3.3），和POSI灰其中扫描整个三维细胞培养物。 在样本选择三个合适的教点，激光移动到每个反过来。获得使用“打印屏幕”的MALDI-TOF激光控制软件的光学照片。 注：许多成像软件程序所需要的样本为'教'，可以用扫描仪或常仪器相机来获得软件的激光的位置，的光学照片。 然后开始从成像软件（未仪器控制）在成像过程并从每个切片获得质谱。观察最群众横跨三维细胞培养物和其他本地化到特定的区域。 9.可选数据分析方法进行有针对性的分析，通过单击平均频谱群众进行光谱的人工分析，或允许成像软件自动选择以上特定阈值群众（ 如 ，AB峰奥雅纳前20％的阈值）。对于质量控制，检验的基质峰分布或平均频谱。 执行统计分析，在数学软件提取的数据集，例如R或Matlab。 以ASCII格式，可读的文本文件，加载到所选择的软件出口单光谱。 各个光谱转换为ASCII的mzML格式，mzXML，对于由几个不同的软件程序读取，28 – 31或数据导出为分析（.IMG）格式的文件中，用于其它成像应用例如MRI共同格式32分析两个开源选项MSiReader和BioMap 32,33。 一旦文件被导出到一个可读的格式，通过软件，通过在各自的软件指令加载数据集。装载之后，执行采集后处理，诸如基线去除和正常化。 有了这个数据集，执行为staticstical治疗，如使用任何自定义脚本或内置算法软件如Matlab 18聚类的主成分分析。