Özet

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Published: January 28, 2015
doi:

Özet

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

Abstract

תרבויות עצביות ספציפיות מחלות של בני אדם הן חיוניות ליצירת מודלים במבחנה למחלות נוירולוגיות אנושיות. עם זאת, היעדר הגישה לתרבויות עצביות מבוגר אנושי ראשוניות מעלה אתגרים ייחודיים. ההתפתחויות האחרונות בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מספקת גישה חלופית לנובעות תרבויות עצביות מfibroblasts העור באמצעות iPSC הספציפי מטופל, אך תהליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, דורש מומחיות מיוחדת וכמויות גדולות של משאבים, ויכולות לקחת כמה חודשים. זה מונע את היישום הרחב של טכנולוגיה זו לחקר מחלות נוירולוגיות. כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, פיתחנו שיטה להפקת תאי גזע עצביים ישירות מהדם היקפי מבוגר אנושי, תוך עקיפת תהליך גזירת iPSC. תאי אבות היווצרות הדם מועשרים מהדם היקפי אדם הבוגר היו בתרבית במבחנה וtransfected עם וקטורי וירוס סנדאי המכילים Sox2 גורמי תעתיק, אוקטובר3/4, Klf4, ו- c-Myc. תוצאות transfection בשינויים מורפולוגיים בתאים שנבחרו עוד יותר על ידי שימוש במדיום עצבי אנושי המכיל גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF) וכלי דם גורם אנדותל צמיחה (VEGF). התאים וכתוצאה מכך מאופיינים בביטוי לסמנים של תאי גזע עצביים, כגון nestin וSox2. תאי גזע העצביים אלה יכולים להיות מובחנים נוספים לתאי עצב, astroglia וoligodendrocytes בתקשורת בידול שצוינה. שימוש בדגימות דם נגיש אנושיות היקפית, שיטה זו יכולה לשמש כדי להפיק תאי גזע עצביים להבחנה נוספת לתאים עצביים לדוגמנות במבחנה של הפרעות נוירולוגיות ועשויה לקדם מחקרים הקשורים להיווצרות המחלה והטיפול במחלות אלה.

Introduction

במבחנה תרבויות עצביות כבר בשימוש ככלי בסיסי ללימודים של מחלות נוירולוגיות. בעלי החיים עיקריים (בעיקר מכרסמים) תרבויות עצביות 1, 2 ושורות תאים עצביות בבני אדם מתוך גליומות או גידולים אחרים הם שימוש נפוץ ביותר במחקרים מסוג זה. עם זאת, זה כבר הכיר בכך שיש הבדלים משמעותיים בין מכרסמים ותאים אנושיים. ממצאים רבים המבוססים על מכרסמים לא יכולים להיות מתורגמים לבני אדם. יתר על כן, עם ההתפתחויות מהירות בניתוח מידע גנומי המוני ועריכת גן קלה יחסית ורצף הגנום כולו, המגמה היא יותר ומכוון יותר לגילוי גנים נוטים מחלה והתוויית הפונקציות ותפקידיהם במחלות ספציפיות, מה שהופך את עצבי האנושיים כמה שורות תאים שרק מוגבלות שימוש. באופן תיאורטי, תרבויות עצביות עיקריות בבני אדם מתוך דגימות של מערכת עצבים מטופל הן הבחירה הטובה ביותר, אבל הם בלתי אפשריים להשיג; ספיד מכאן חלופיods נחוץ. בשנים האחרונות, כמה גישות כבר רדפו, עם שני להיות המובחנים ביותר. בעקבות הפיתוח של הטכניקה של תאים לייצר מושרה pluripotent גזע (iPSC) עכבר באמצעות תאים סומטיים ואדם 3, 4, תאים עצביים יכולים להיות מובחנים נוסף מהם 5-7. עם זאת, יצירה ואפיון iPSC דורשת עבודה אינטנסיבית, טכניקות, וקלט זמן, לפעמים אפילו להחריד. זמן קצר לאחר, גישה אחרת פותחה כדי להפוך ישירות תאים עצביים מהתאים סומטיים 8, 9. כתאי עצב וכתוצאה מכך הם אינם שגשוג, הוא מגביל היישום שלה בלימודים אינטנסיביים והקרנת סמים, אשר דורשת כמות גדולה של תאים. לקחת את היתרונות של שני השיטות, הגזירה ישירה של גזע עצבי / תאי אב מהתאים סומטיים נחקרו על ידי מספר קבוצות 10-12, שעוקפת את התהליך מייגע של דור iPSC ואפיון אבל עדיין provides מספר מכובד של תאי גזע עצביים לבידול עצבי מאוחר יותר. הראינו בעבר כי בעקבות כניסתה של גורמי שעתוק יאמאנאקה לתאי דם, תאי גזע עצביים יכולים להיות שנוצרו ישירות באמצעות תא עצבי בחירה בינונית 13. כאן, אנו מדווחים על השיטה בפירוט.

Protocol

1. תאי ההעשרה של Hematopoietic אב מהדם כל מבוגרים יכולים להיות מטוהרים ותאי Hematopoietic או CD34 + תאים מהתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) נגזרים ממגוון רחב של מקורות, כולל דם טבורי, חומר leukapheresis וכל דם תוך שימוש בשיטות המבוססות צנטריפוגה שיפוע צפיפות:…

Representative Results

האיכות של תאי CD34 היא קריטית להצלחה של התמרה של תאי גזע עצבי. תאי CD34 באיכות גבוהה להתרבות במהלך כמה ימים של התרבות הראשונה ומופיעים כחסיד עישון, תאים עגולים homogenously, צפים מעל התחתית של כלי תרבות (איור 1 א). תוצאות הזיהום המוצלחות באגרגטים תא, אשר מרחיב לאורך ה?…

Discussion

פרוטוקול מפורט ליצירת תאי גזע עצביים ישירות מתאי hematopoietic היקפיים מסופק.

בהשוואה לתאים פיברובלסטים, דם היקפי אדם הוא נגיש יותר. תוך שימוש בפרוטוקול שהוצג, יותר מ 1 x 10 5 תאי דם, או תאים חיוביים CD34, יכול להיות מועשר מ 10 מיליליטר ש?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Materials

Material List
Name Company Catalog Number Yorumlar
Lymphocyte Separation Medium Lonza 17-829E 1 X
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 mL
Human Serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl  2mM
MACS LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM Medium Stemcell Technologies 9650 1X
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1X
TPO Peprotech 300-18 100 ng/mL
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/mL
SCF Peprotech 300-07 100 ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/mL
IL-7  Peprotech 200-07 20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit Life technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life technologies 12400-024 1X
N2 supplement Life technologies 17502-048 1X
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life technologies 17504-044 1X
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-Ornithine Sigma P4957 1X
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1X
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 ug/ml

Referanslar

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

View Video