High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Anup D. Sharma; Pavel A. Brodskiy; Emma M. Petersen; Melih Dagdeviren; Eun-Ah Ye; Surya K. Mallapragada; Donald Sakaguchi

doi:10.3791/52242

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Tıp

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Published: January 04, 2015

doi:

10.3791/52242

Anup D. Sharma¹, Pavel A. Brodskiy^1,3, Emma M. Petersen^2,3, Melih Dagdeviren², Eun-Ah Ye², Surya K. Mallapragada¹, Donald Sakaguchi^2,3

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Iowa State Üniversitesi, ²Department of Genetics, Development and Cell Biology,Iowa State Üniversitesi, ³Biology Program,Iowa State Üniversitesi

Özet

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).

Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.

Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.

Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.

This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Introduction

Eines der Hauptprobleme bei der Durchführung nützliche Therapien zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems ist bei der Entwicklung wirksamer Methoden, die weitere Degeneration verhindern und Wiederherstellung der Funktion zu erleichtern. Eine innovative Strategie Genmanipulation Stammzellen ex vivo, für die Herstellung von neuroprotektiven Faktoren, vor ihrer Transplantation. Diese Kombination von zellbasierte Therapie in Verbindung mit einer Art von Gentherapie, ein leistungsfähiges Verfahren für die Behandlung von Krankheit oder Verletzung induzierten neuronalen Zelltod im Nervensystem.

Neurotrophe Faktoren sind entscheidend für Wachstum und Überleben von sich entwickelnden Neuronen sowie Wartung und Plastizität von reifen Nervenzellen. Eine Reihe von Studien haben eine bedeutende Rolle von neurotrophen Faktoren bei der Förderung der anfänglichen Wachstum und die Differenzierung von Neuronen im zentralen und peripheren Nervensystems (ZNS und PNS) gezeigt, und sie können auch dazu anregen Regeneration in vitro und in einemnimal Modelle von Nervenverletzungen ^ein. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ist hoch im ZNS exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung des Nervensystems, die synaptische Plastizität und Reparatur ^2. Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) fördert das Überleben vieler Arten von Neuronen, einschließlich dopaminerger und Motoneuronen ^3. Somit ist es eine wichtige Strategie zur neuronalen Reparatur exogenen Quellen von neurotrophen Faktoren auf die verletzte oder erkrankte Bereiche des Nervensystems.

Multiknochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) ein großes Potential für die Lieferung von therapeutischen Proteinen, um die beschädigte oder erkrankte Nervensystems zu behandeln. Transplantation von MSCs beträchtliche Aufmerksamkeit in den Bemühungen des Patienten kompatibel zellbasierten Therapien zu entwickeln zogen, da sie eine Reihe von Vorteilen, einschließlich: 1) der relativen Leichtigkeit der Isolierung und Wartung, 2) multipotente Fähigkeit, 3) kleiner ethische Bedenken und 4 haben) Überlebensfähigkeit und wandern nach der Transplantation und 5) Potenzial für autologe Transplantation ^4,5. Vielversprechende Ergebnisse wurden bei Verwendung von naiven und gentechnisch MSCs in Tiermodellen für eine Vielzahl von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks ^6,7, Schlaganfall ^8,9, Myelinmangel ¹⁰ und Netzhautdegeneration ^11-13 berichtet. Koppeln Zelltransplantation mit der Lieferung von neurotrophen Faktoren aus gentechnisch veränderten Stammzellen ist ein neuartiges und wichtiges neuronales Reparaturstrategie.

Ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung von zellbasierten therapeutischen Faktor-Delivery-Systeme, die normale Gesundheit der gentechnisch veränderten Zellen zu bestimmen. Als solches ist das Hauptziel dieser Studie war es, allgemeine Wachstumsparameter von gentechnisch veränderten adulten Stammzellen zu bewerten. Ein wichtiger Ansatz zur raschen Einschätzung mehrerer Zellparametern ist es, zelluläre bildbasierten Hochdurch screenin beschäftigeng (HTS), die oft als High Content Screening (HCS) Verfahren ¹⁴ bezeichnet. Diese Technologie ermöglicht die automatisierte Bildaufnahme und Analyse, und dieser Ansatz ist besonders gut für die Stammzellenforschung Anwendungen geeignet. In diesem Projekt haben wir eine Profiling-Plattform, die für die schnelle Charakterisierung und Optimierung von Zellsubstrat Vorlieben und Zellfunktionen mit gentechnisch veränderten adulten Stammzellen unter Verwendung einer HCS-System ermöglicht.

Protocol

1. Untergrundvorbereitung für 96-Well-Platten Erstellen Sie eine Karte von der 96-Lochplatte umreißt die verschiedenen Substrate und Zelltypen zu (Abbildung 1) untersucht werden. Besorgen Sie sich die Stammlösungen von unterschiedlichen Substraten [Poly-L-Lysin, Fibronektin, Kollagen Typ I, Laminin und Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL)], ein 96-Loch-Multiwellplatte und erstellt einen Arbeitsplatz in einem sterilen Zellkultur Kapuze. Planen einzelner Substrate durch Verdünnen Lager in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 5 ug / ml (diese Konzentration wurde zuvor basierend auf einer Substratkonzentration abhängigen Assay für Wachstum und Vermehrung der Zellen bestimmt). Mischen mit einem Vortex vor dem Gießen in einen sterilen Behälter. 100 l Substratlösung in jede Vertiefung nach dem 96-Loch-Karte (Abbildung 1) (a 12- oder 8-Kanal Mikropipette ist für Mikropipettieren in eine Platte mit 96 Vertiefungen). Verschließen Sie den Deckel auf die 96-Lochplatte mit einem Streifen Parafilm und über Nacht bei 4 ° C. 2. Zell Plating und Zeitraffer-Imaging HINWEIS: Maus-MSCs wurden aus dem Knochenmark von Erwachsenen C57BL / 6-Mäusen isoliert und als adhärente Zelllinie beibehalten wird. Und Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF; menschliche cDNA) unter Verwendung von lentiviralen Vektors kodiert BDNF (LV-BDNF;; MSCs wurden mit lentiviralen Vektoren, sie zu konstruieren, um dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (human cDNA BDNF) sekretieren infiziert CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). HINWEIS: Die Kulturmedien für Maus mesenchymale Stammzellen (MSCs) ist Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium, das 10% Hybridom-qualifizierte fötalem Rinderserum, 10% Pferdeserum, 2 mM L-Glutamin und 10.000 U / ml Penicillin, 10 mg / ml Streptomycin . Die fünf verschiedenen Arten von Maus-MSCs (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden bei etwa 30% Konfluenz in T75 Zellkulturflaschen ausplattiert. Zelle Plating Am folgenden Tag, nehmen Sie die Substratlösungen durch Aspiration und spülen Sie jede Vertiefung mit etwa 200 ul sterilem PBS, zweimal. Hinzufügen Zellkulturmedien (200 ul / Vertiefung) in jede Vertiefung nach dem letzten PBS spülen. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für die Gleichgewichtseinstellung eingestellt. (Bezeichnet als konditioniertes Medium), während der 96-Well-Platte wird in den Inkubator Äquilibrieren, Ernte der Zellen durch das Sammeln des Wachstumsmediums (MSCs in T75 Kolben sollten etwa 70% konfluent Zeitpunkt der Ernte / Beschichtung sein kann) von der T75-Kolben und Speichern in einem 15 ml konischen Röhrchen unter sterilen Bedingungen (das konditionierte Medium wird im Schritt 2.1.4) verwendet werden. In 8 ml sterilem PBS in den Kolben und schwenken Sie dann pipettieren Sie das PBS und 1 ml 0,05% Trypsin und 0,01TA-Lösung, um die Zellen von der Kulturoberfläche des T75-Kolben zu lösen. Überwachen Zellablösung durch Betrachten der Kolben unter Verwendung eines Umkehrmikroskops mit Phasenkontrastoptik ausgestattet. Wenn die Zellen abgenommen, sofort 8 ml der konditionierten Medien (in Schritt 2.1.2 gesammelt) in den Kolben. Sammeln Sie die Zellsuspension und Transfer zu einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 4 Minuten bei 450 · g, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 200 & mgr; l frisch und erwärmt (37 ° C) Zellkulturmedien. Bestimmen der Anzahl der Zellen in der Zellsuspension durch Ausführen einer Trypanblau Lebendzellzahl unter Verwendung eines Hämocytometers. Platte, die Zellen in einer Dichte von etwa 300 Zellen / Vertiefung in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Population von Zellen. Zeitraffer-Imaging Sobald alle MSCs wurden vernickelt, OrtDie 96-Well-Platte in einen Inkubator für 2 h, damit sich die MSCs an dem Substrat zu befestigen. Starten Sie den HCS-System und warten Sie 2 Stunden für das System ins Gleichgewicht kommen. Setzen Sie den Umgebungsregler auf 37 ° C und eine Verbindung eines Mischgases Zylinder, enthaltend 5% CO 2 in Luft zu dem HCS System Umgebungskammer Zuführen eines konstanten Luftquelle. Entfernen Sie den 96-Well-Platte aus dem Inkubator nach 2 h Äquilibrierungsperiode und legen Sie direkt in die Zellwachstumskammer des HCS-System. Lassen Sie 30 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung aus irgendeinem wärmebedingte Ausdehnung der Platte Konto und starten Sie die Bildaufnahme und Analyse-Software, um die Platte zu konfigurieren. Wählen Sie das 20X Ziel für die Bildgebung. Wählen Sie zwei Vertiefungen pro Bedingung [dh GFP-MSCs auf Fibronektin usw. (6 Substraten x 5 MSC Subtypen für insgesamt 30 Bedingungen x 2 Wiederholungen = 60 Bohrungen insgesamt)] für den Aufbau Zeitraffer-Bildgebung. Wählen Sie zwei Standorte für die Bildgebung mitin jede Vertiefung. Wählen Sie die richtige Lichtwellenlängen für die Bildgebung. HINWEIS: Zwei verschiedene Wellenlängen (Phasenkontrast und GFP-Fluoreszenz) wurden für Zeitraffer-Bildgebung ausgewählt. Konzentrieren Sie sich auf die Well-Boden mit Laserautofokus und nehmen Sie Testbilder für mehrere Standorte und mehrere Brunnen, um eine optimierte Brennebene zu finden. Sobald der Fokus festgelegt wurde, beginnt die Aufnahme von Bildern alle 5 min für 48 Stunden für alle 60 Bohrlöcher (120 Websites). Feed the Zellen alle 24 Stunden durch das Entfernen der Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Entfernen 75 ul Medium aus jeder Vertiefung werden 100 ul frisches Medium zu jeder Vertiefung (äquilibrieren dieses frischem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2). Am Ende des Zeitraffer-Experiment, entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen aus dem HCS-System. Unter sterilen Bedingungen sammeln die konditionierten Medienproben aus jeder Vertiefung und übertragen diese Proben auf eine andere Platte mit 96 Vertiefungen. HINWEIS: Diese Proben können für die weitere Analytik eingesetzt werdenwird durch Ausführen ELISA für neurotrophe Faktoren. Bereiten Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit kultivierten MSCs für weitere Tests, wie Ki67-Zellproliferationstest oder Propidiumiodid Live / Dead Färbeassay (Details siehe unten). Führen Sie Zeitraffer-Imaging-Analyse für die Zellmigration / Zellverfolgung wie in Abschnitt 5 beschrieben. 3. Ki67 Zellproliferation und Propidiumiodid Live / Dead-Assay Ki67 Cell Proliferation Assay (Immunzytochemie) Spülen der Zellkulturen mit 0,1 M Phosphat (PO 4) Puffer für eine Minute zweimal. Befestigen Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie die Vertiefungen mit PBS sieben Minuten drei Mal. Nach der letzten Spülung 100 l Blocker-Lösung (Phosphatpuffersalzlösung, 5% normalem Eselserum, 0,4% Rinderserumalbumin und 0,2% Triton X-100) in jede Vertiefung einnd Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Vorbereiten des primären Antikörpers, Kaninchen-Anti-Ki67, durch Verdünnen in Blocker-Lösung bei einem Bearbeitungsverhältnis von 1: 200. Entfernen den Blocker-Lösung und gelten 100 ul des primären Antikörperlösung in jede Kammer. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Inkubieren der Proben bei 4 ° C über Nacht. Am folgenden Tag, nehmen Sie die Antikörperlösung und mit PBS spülen für 7 min, 3-mal. Vorbereiten des sekundären Antikörper, Esel Anti-Kaninchen-Cy3 in Blockierungslösung bei einem Arbeitsverhältnis von 1: 500. Hinzufügen DAPI Kernfärbung auf die Sekundärantikörperlösung bei einer Verdünnung von 1: 100. Nach der Entfernung des letzten PBS spülen gelten 100 ul des sekundären Antikörper / DAPI-Lösung zu jedem Well. Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln für 90 min. Entfernen Sie den sekundären Antikörper / DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. Propidium Iodid Live / Dead-Assay Messen Zelltod durch Propidiumjodid (PI) Ausschluss-Assay, wie unten beschrieben. Bereiten Sie die Propidiumiodid-Färbung Lösung bei einer Konzentration von 1,5 uM in Kulturmedien. 100 l 70% Ethanol, um eine Vertiefung der MSCs für 2 Minuten mit der Absicht, diese Zellen zu töten. Dies dient auch als eine positive Kontrolle für die PI-Färbung. Der Großteil der MSCs werden PI-gefärbte Angabe Zelltod sein. Entfernen Sie die Ethanollösung. 100 l Propidiumiodid-Färbung Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Spüle die Zellen mit 0,1 M Phosphatpuffer für 1 min, 2 mal. Fixieren die Zellen mit 4% PFA in 0,1 M P0 4 Puffer für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die PFA und mit PBS spülen dreimal für 7 min. Inkubieren mit DAPI-Lösung (1:50) in Blocker-Lösung 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Alle Vertiefungen mit SpülenPBS für 7 min, 3-mal. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung mit PBS für 7 min, 3-mal. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 4 ° C bis zur Bildgebung. 4. Automated Imaging und Multiwellenlängen Scoring Analyse Legen Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen (zuvor für Ki67 Immunmarkierung oder Propidiumiodid-gefärbten verarbeitet) in die HCS-System und damit die Platte für 20 Minuten ins Gleichgewicht Öffnen Sie die HCS-System-Image-Erfassung und Analyse-Software. Wählen Sie die Einstellungen für den Erwerb 10X-Objektiv von der Kamera aus Binning bei 1 und eine Verstärkungseinstellung des 2. Suchen Sie die Z-Ebene, in der sich die Zellen befinden durch die Nutzung der automatischen Belichtungsfunktion und berechnet den Offset für jede Wellenlänge von Interesse. Für diese Analyse wurden die Aufnahmen für DAPI (W1), Cy3 (W2) und FITC (W3). Wählen Sie die maximale Intensität Ebene, auf der die Negativkontrollen zeigen kein Signal für die Bildaufnahme. Bestätigen Sie die Einstellung für die pos geeignet istitive Brunnen. Erwerben Platte. Machen Sie Bilder und speichern sie in der Bildaufnahme und Analyse-Software-Datenbank. Sobald Bilder erworben wurden, offene Bildaufnahme und Analyse offline Software und Überprüfung Platte Daten aus den obigen Bilder erworben. Wählen Sie das Multi-Wellenlängen-Scoring-Analyse. Konfigurieren Sie die minimale und maximale Intensität für jede Wellenlänge. HINWEIS: DAPI Erkennung sollte die Färbung um jeden sichtbaren Kern markieren. Cy3 sollten die positiven Zellen mit Ki67 Immunreaktivität (IR) zu erkennen und sollte IR unter den negativen Kontrollen nicht erkennen. Cy3 Ki67 IR, die ungefähre minimale Breite betrug 7 & mgr; m, ungefähre Maximalbreite betrug 30 & mgr; m, wird die Intensität über dem lokalen Hintergrund betrug 150 Graustufen und die minimale Buntbereich betrug 50 & mgr; m 2. Führen Analyse für alle Positionen. Exportieren Sie die Daten in Spreadsheet anzuzeigen. 5. Zelltracking Bild öffnen Acquisition und Analyse-Programm und klicken Sie auf "Bewertung Platte Daten [DB] …", die Auswahl der Platte von Interesse. Die Daten anzuzeigen, wie "Time vs. Well". Wählen Sie eine der Webseiten, die im Abschnitt "Seiten" auf der linken Maustaste auf die gewünschte Auswahl. Wählen Sie "Übertragene …" unter den "Wellenlängen:". Rechtsklick auf das Ziel auch in der 96-Well-Platte-Vorlage und klicken Sie auf "Bilder laden". Verfolgen Sie die Zellen, indem Sie auf den "Apps" und dann "Track-Objekte". Verwenden Sie "Dynamic Data Exchange (DDE)", um das Format, um die Daten, zum Beispiel Microsoft Excel exportieren. Wählen Sie die Tracking-Daten zu exportieren, zum Beispiel, vergangene Zeit, Objektnummer, Entfernung, Zeit-Intervall, Geschwindigkeit, absoluten Winkel, Entfernung zum Ursprung, Delta x und Delta y. Tag jede Zelle von Interesse mit "Strg-Taste + linke Maustaste" auf den Zielzellen. Track-Zellen. Stoppen Sie gegebenenfalls / ändern unsachgemäße Tracking von Zellen mit der Taste "Esc" und passen Sie die Einstellungen. Nach Zellverfolgung abgeschlossen ist, speichern Sie Daten mit "Protokolldaten".

Representative Results

MSC Wachstumsparameter wurden durch Kultivierung der verschiedenen Populationen von MSCs auf unterschiedlichen Substraten untersucht. Die fünf verschiedenen Populationen von MSC-Subtypen (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs und BDNF / GDNF-GFP-MSCs) wurden in 96-Well-Gewebekulturplatten mit unterschiedlichen vorbeschichtet plattiert Substrate, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach vier Tagen Kultivierung wurden die Platten fixiert und immunmarkierten und / oder mit den entsprechenden Reagenzien gefärbt und unter Verwendung des HCS System dann untersucht und Analysen mit der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm durchgeführt. Fig. 1: 96-Well-Platte Vorlage für experimentelle Design 96-Well-Platten wurden mit verschiedenen Substraten und Vertiefungen beschichtet wurden mit Engineered Stammzellen geimpft, wie in der Schablone gezeigt. Als Beispiel wird nur wells in Reihen BF wurden in diesem Experiment verwendet. Reihen A, G und H wurden leer gelassen. Abkürzungen – MSCs: mesenchymale Stammzellen; GFP-MSCs: grün fluoreszierende Protein-exprimierenden MSC; BDNF-GFP-MSCs: brain derived neurotrophic factor-GFP-exprimierenden MSC; GDNF-GFP-MSCs; Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor-GFP-exprimierenden MSCs; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; BDNF und GDNF- GFP exprimierende MSCs; ECL: Entactin-Collagen IV-Laminin). Anti-Ki67 Immunmarkierung, gefolgt von DAPI Gegenfärbung wurde verwendet, um zu bewerten, ob die verschiedenen Substrate beeinflußt Proliferation der verschiedenen Populationen von Engineered MSCs (2A). Die Expression des Antigens Ki67 läuft bevorzugt in der späten G 1, S, G 2 und M-Phasen des Zellzyklus und wird nicht in den Zellen in der Ruhephase (G 0) erkannt wird, und ist daher geeignet als zellulärer Marker für die Proliferation 15 . 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) ist eine häufig verwendete nuklar und Chromosomengegenfärbung, die blaue Fluoreszenz bei der Bindung an AT Regionen der DNA 16 abgibt. Die Gesamtzahl der Zellen in einem Bereich, kann durch Zählen der Anzahl von DAPI Kerne bestimmt werden. Wie in 2B dargestellt ist, obwohl es Variationen in den Prozentsätzen von proliferierenden MSCs, alle Substrate dennoch beträchtliche Zellproliferation für jede der MSC Subtypen unterstützt. Abbildung 2: Ki67 Zellproliferationsassay. (A) verschmolzen, doppelklicken Fluoreszenzbild von Ki67 Immunmarkierung (rot) und DAPI (blau) Kernfärbung. Viele der MSCs wurden mit dem Ki67-Antikörper (rot) immunmarkiert. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (B) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Ki67 immunolabeled MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, KollagenTyp I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Propidiumiodid (PI) Färbung wurde verwendet, um zu beurteilen, ob verschiedene Substrate beeinflussen das Überleben der Zellen (Abbildung 3). Propidiumiodid ist eine häufig verwendete Rot-Fluoreszenz Kern- und Chromosomen-Gegenfärbung. Propidiumiodid ist Membran impermeant und allgemein von lebensfähigen Zellen ausgeschlossen sind, und ist daher nützlich, um tote Zellen zu erkennen in einer Population. Der Anteil von toten Zellen in einer gegebenen Bedingung bestimmt, wenn sie mit einer allgemeinen Kern Markierung, wie DAPI kombiniert, um alle Zellen innerhalb eines Feldes zu identifizieren. Der Anteil der PI-positiven Zellen war niedrig auf allen untersuchten Substraten (Abbildung 3). Als positive Kontrolle für die PI-Reagenz wurden einige Vertiefungen, die MSCs in 70% Ethanol inkubiert wurde, was üblicherweise für die meisten Zellen zu töten, was zu einem hohen Prozentsatz an PI-markierten Zellen, wie in 3B und 3C dargestellt (Ethanol behandelt positive Steuerung). Abbildung 3: Propidiumiodid Zelltod-Assay. (A) verschmolzen, Doppelfluoreszenzbild für Propidiumiodid (rot) und DAPI (blau) Färbung. Obwohl die Kerne aller lebensfähigen Zellen wurden mit DAPI (blau) gefärbt wurde keine Propidiumiodidfärbung im MSCs. (B) praktisch alle MSCs wurden mit Propidiumiodid nach Exposition mit 70% igem Ethanol gefärbt erkannt. Maßstabsbalken in A und B = 100 & mgr; m. (C) Balkendiagramm, das die Prozentsätze der Propidiumiodid (PI) gefärbt MSC SubtypS auf Polystyrol (PS), Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, Entactin und Kollagen-IV-Laminin (ECL) Substrate für 5 Tage in vitro (DIV) gezüchtet. Ethanol Steuerung: Diese Bedingung diente als positive Kontrolle für die PI Färbereagenz. Die meisten Zellen zu PI-Färbung nach Ethanol-Behandlung unterzogen sind tot und damit positiv für den PI-Reagenz gefärbt. N = einem Experiment. Jeder Balken stellt gemittelt gepoolten Daten aus 8 abgebildet Webseiten, die auf 2 Brunnen für jede Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Um den möglichen Einfluss von verschiedenen Substraten auf das Verhalten von technischen MSCs, Zellmigration wurde mit Zeitraffer digitale Mikroskopie und den Durchlicht / Klimakammer-System auf dem HCS-System analysiert untersuchen (siehe Zusatz Video 1). Mehrere Standorte / Vertiefung wurden Zeitraffer abgebildetund verwendet, um die Zellmigrationsraten für die verschiedenen Subpopulationen von MSCs wachsen auf den verschiedenen Substraten mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software zu berechnen. Im Allgemeinen, wie in 4C gezeigt, alle Subtypen von MSCs zeigte die schnellste Migrationsrate auf die extrazelluläre Matrix-beschichteten Oberflächen (Fibronectin, Kollagen, Laminin und ECL) und dem langsamsten auf nicht-beschichteten Polystyroloberflächen. Abb. 4: Zellverfolgung und Migration MSCs verfolgt mit der Bildaufnahme und Analyse-Software. Überlagerten Bilder der Durchlicht und Fluoreszenzbilder von (A) dem Beginn der Zeitraffer-Imaging und (B) 29 Stunden später am Ende des Zeitraffer-Imaging-Sitzung (siehe Zusatz Video 1). Zellmigration Spuren durch die farbige li angegebennes. Maßstab:. 50 um (C) Balkendiagramm, das durchschnittliche Migrationsraten (als & mgr; m / h ausgedrückt) zum MSC Subtypen von Polystyrol (PS) gewonnen, die Poly-L-Lysin (PLL), Fibronektin, Collagen vom Typ I, Laminin, oder Entactin-Kollagen IV-Laminin (ECL) Substrate für 2 Tage in vitro (DIV). N = einem Experiment. Jeder Balken stellt den Mittelwert von mindestens 10 abgebildet Zellen von 2 Brunnen für jede Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse liefern erste Hinweise, dass diese Subpopulationen von gentechnisch MSCs ähnliche Wachstumseigenschaften anzuzeigen. Diese Ergebnisse liefern überzeugende Beweise, dass der lentivirale vermittelten genetischen Veränderungen dieser MSCs induzierte keine dramatischen nachweisbare schädliche Auswirkungen auf die Wachstumsparameter untersucht mit dieser Screening-Plattform. <p class= "Jove_content"> STADT Video 1. Zeitraffer-Digital-Video von MSC-Tracking mit Hilfe der Bildaufnahme und Analyse-Software-Programm. Die Migration ist für zwei MSCs [wie 1 (grün Spurlinie) und 2 (Blau-Tracking-Linie) angegeben] dargestellt. Video während einer 29 Stunden-Zeitraum erfasst. Bilder wurden alle 5 Minuten eingefangen. Fluoreszenzbilder der GFP-exprimierenden MSC wurde für Zeitraffer-Bildgebung bei der Erstellung des Videos verwendet. Kalibrierung bar = 50 & mgr; m. Diese Art der Analyse ist für die Untersuchung der Zellverhalten, einschließlich der Zellmigration und der Zellteilung.

Discussion

Adulte mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine attraktive Zelltyp für die Entwicklung einer experimentellen Strategie, die eine zelluläre und Genabgabe basierte Therapie. MSCs sind multipotent, zur Differenzierung zu Zellen mesodermalen Linie und zeigen erhebliche Plastizität, Differenzierungs / Transdifferenzierung zu neuronalen und glialen Linien mit der entsprechenden Induktions Paradigmen ^17,18. Weiterhin MSCs transplantiert wurden und wirksam erwiesen in präklinischen Studien für eine Reihe von Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Bedingungen ^19. Die therapeutische Wirksamkeit von MSCs ist gut aufgrund ihrer günstigen anti-proliferative, anti-entzündliche und anti-apoptotischen Aktivitäten ²⁰ bekannt. MSCs sind ebenfalls bekannt, verschiedene neurotrophe und Wachstumsfaktoren, die trägt wahrscheinlich zu den neuroprotektiven Eigenschaften mit naiven MSCs nach der Transplantation an den Stellen der Verletzung oder Erkrankung ²¹ verbunden zu produzieren und zu sezernieren. Importantly können MSCs genetisch unterstützte Abgabe von neurotrophen Faktoren für kombinierte zellulare und Gentherapie-Anwendungen modifiziert werden, und sind in einer Reihe von Tiermodellen der Verletzung oder Krankheit des ZNS ^11,19,22 eingesetzt.

In der Entwicklung eines kombinierten Zell- und Gentherapie-basierte Strategie ist es wichtig, dass die Gesundheit der Zellen sorgfältig vor der umfassenden Nutzung für die in vitro und insbesondere in vivo Anwendungen bewertet. Wie Proof of Concept, untersuchten wir mehrere Populationen entwickelt und Steuer MSC Linien, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen auf Zell Gesundheit und Fitness mit einem High Content Screening (HCS) Ansatz zu studieren. In der Regel bezieht sich auf Zell HCS bildbasierten Hochdurchsatzscreening ^14. Dieses Screening-Ansatz ermöglicht eine quantitative Beurteilung der zellulären Phänotypen auf mehreren Ebenen von räumlichen (Zelle auf subzellulärer) und zeitliche (Millisekunden bis Tagen) reslösung in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Mit diesem Ansatz haben wir mögliche Unterschiede in der Substratpräferenz von folgenden Parametern aufgerufen: Zellproliferation, Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), Zelltod und Zellbeweglichkeit / Migration. Die Experimente wurden in 96-well-Zellkulturplatte Format ausgelegt. Innerhalb einer einzigen Platte wir routinemäßig auf die einzelnen Parameter für die verschiedenen MSC Populationen lentiviralen-transduzierten Zellen untersucht mögliche Substratspezifische Unterschiede in Bezug und verglichen die entwickelt MSCs mit der ursprünglichen, nicht-transduzierten MSCs. Dies ergab ein Mittel, um direkt mit einer Reihe von In-vitro-Assays wie Zellproliferation mit Ki67 Immunmarkierung, Live / Dead-Zelllebensfähigkeitstest mit Propidiumiodid-Färbung, und das Zellverhalten, indem Sie Zeitraffer Digital Imaging vergleichen Sie die Ergebnisse für die verschiedenen Subtypen MSC . Als eine Erweiterung dieser HCS kann man auch durchführen ELISAs auf konditionierten Medienproben aus einzelnen w gesammeltenells quantitativ zu bestimmen Sekretion von neurotrophen Faktoren. Konditionierte Medien aus verschiedenen MSC-Subtypen können auch in in vitro Bioassays zur biologischen Aktivität von sezernierten Faktoren ^11,23 bestimmen. Diese Art von HCS-Plattform kann auch für in vitro-Messungen von Neuritenwachstum aus primären neuronalen Kulturen und neuronale Stammzelllinien ²⁴ verwendet werden. Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Subpopulationen der genetisch veränderten MSCs ähnelnde Verhalten im Vergleich zu den nicht modifizierten MSCs. Der Einfluss verschiedener Kultursubstrate auf Zellwachstum und Zellmigration war nicht dramatisch verschieden zwischen den MSC-Subtypen sowie Kultursubstraten. Als solche hat die extrazellulären Matrixsubstrate getestet anscheinend nicht eine kritische Rolle bei der Modulation dieser Aspekte des Zellverhaltens für diese unterschiedlichen Engineered MSCs spielen.

Diese Studie zeigt die Verwendung eines HCS System zum Analysieren von different Aspekte des Zellverhaltens. Jedoch ist es nicht ungewöhnlich, dass Einschränkungen bei der Bildanalyse zugeordnet stoßen. Gelegentlich, während die Analyse der Fluoreszenzbilder, war es etwas schwierig, den richtigen Schwellenwert, ab dem immun oder gefärbten Zellen würde gezählt als positiv bezeichnet / gefärbt werden zu bestimmen. Somit subjektiven Bias zu minimieren, wird die Bestimmung von Schwellenwerten war abhängig von einem Vergleich mit den Kontrollen (negative Kontrollen für die Fluoreszenz-Bildgebung wurden parallel bei allen Verarbeitung durch das Weglassen der primären oder sekundären Antikörper durchgeführt). Eine weitere Einschränkung wurde bei der Analyse der Zellmigration mit Zeitraffer Digital Imaging gestoßen. In einigen Fällen war die Bildverarbeitungssoftware nicht in der Lage, zwischen zufälligen Brownsche Bewegung einer Zelle gegenüber einer Zelle tatsächlich Migration nur eine sehr kurze Strecke zu unterscheiden. Zusätzliche Beschränkungen waren deutlich in Situationen, in denen die Analysesoftware nicht in der Lage, das Vorhandensein von multip unterscheidenle Zellen in unmittelbarer Nähe zu einem anderen. Um diese Einschränkung zu erforderlichen manuellen Zellenauswahl während der Analyse eher als eine vollautomatische Analyse zu überwinden. Zell Plattierungsdichte kann auch in Schrägzellmigration von Daten zwischen Populationen von Zellen, die größer ist bevorzugt in Klumpen gegen Zellen, die isoliert von einander wachsen wachsen Anzeigen führen. Diese Arten von Unterschiede sind zum Teil eher ein Spiegelbild der Zell-Substrat-gegen Zell-Zell-Vorlieben.

Mit einem HCS-System, um Bilder zu erfassen und führen Sie Datenanalysen bietet ein effizientes und schnelles Mittel, um mehrere Zellparameter zu bewerten. Darüber hinaus wurden im Zeitraffer digitale Videos für 30 verschiedene Bedingungen (6 Substraten und 5 verschiedene MSC-Subtypen) routinemäßig für die Zeiträume von Stunden bis Tagen (48 Stunden) während der Verwendung der Klimakammer erworben. Diese Daten wurden anschließend verwendet, zu berechnen und zu bestimmen, Unterschiede in der Zellmigration Raten in verschiedenen Zelllinien auf verschiedenen ECMMolekülen.

In diesem Bericht haben wir die Implementierung einer High Content Screening-Plattform, um die Zell Gesundheit und Funktion beurteilen hervorgehoben. Diese Art der Analyse ist für die Entwicklung von Strategien zur rationellen Gestaltung von Zelltypen, wie auch Polymersubstrate gerichtet Zellwachstum und die neuronale Regeneration zu erleichtern. Dies ist ein wesentlicher Schritt in Richtung Anwendung von stammzellbasierten Abgabe therapeutischer Faktoren vor umfangreiche präklinische Studien in vivo mittels Zelltransplantation Strategien.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materials

96 well plates	Greiner Bio One	655090	96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody	Abcam (Cambridge, MA)	Ab16667	1:200 dilution
Collagen type I	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	C7661	Collagen from rat tail
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	711-165-152	1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin)	Millipore/Chemicon (Temecula, CA)	08-110
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Logan, UT)	SH30071.03
Equine serum	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
Ethanol	Chemistry Store (Ames, IA)	12003510	100%, 200 proof
Fibronectin	Fisher Scientific (Hampton, NH)	CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
KH₂PO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P285	For PO₄ buffer
K₂HPO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	For PO₄ buffer
L-Glutamine	Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)	25030-081
Laminine (mouse)	Trevigen (Gaithersburg, MD)	3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice	Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)		Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)	These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	4% PFA in 0.1M PO₄ buffer
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4707
Propidium iodide (PI)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	P1304MP
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1X)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Invitrogen (Carlsbad, CA)	12440–046
Hybridoma-qualified FBS	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
Equine serum	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
ImageXpress Micro	Molecular devices (Sunnyvale, CA)	ImageXpress micro	High content screening system
MetaXpress 4.0	Molecular devices (Sunnyvale, CA)	MetaXpress 4.0	Image acquisition and analysis software

Referanslar

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Mesenchymal Stem Cells Genetic Modification Brain-derived Neurotrophic Factor Glial Cell-derived Neurotrophic Factor High Content Screening Cell Adhesion Cell Proliferation Cell Migration Cell Viability Neuroprotective Strategies

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