High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Anup D. Sharma; Pavel A. Brodskiy; Emma M. Petersen; Melih Dagdeviren; Eun-Ah Ye; Surya K. Mallapragada; Donald Sakaguchi

doi:10.3791/52242

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Published: January 04, 2015

doi:

10.3791/52242

Anup D. Sharma¹, Pavel A. Brodskiy^1,3, Emma M. Petersen^2,3, Melih Dagdeviren², Eun-Ah Ye², Surya K. Mallapragada¹, Donald Sakaguchi^2,3

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Iowa State Üniversitesi, ²Department of Genetics, Development and Cell Biology,Iowa State Üniversitesi, ³Biology Program,Iowa State Üniversitesi

Özet

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).

Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.

Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.

Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.

This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Introduction

נושא מרכזי ביישום טיפולים יעילים לטיפול בהפרעות במערכת עצבים הוא בפיתוח שיטות יעילות המונעות ניוון נוסף וגם להקל על התאוששות של תפקוד. אסטרטגיה חדשנית היא גנטי בתאי גזע מהנדס לשעבר vivo, לייצור של גורמי הגנה עצביים, לפני ההשתלה שלהם. זה שילוב של טיפול מבוסס תאים, בשילוב עם סוג של ריפוי גנטי, מספק שיטה רבת עוצמה לטיפול במחלה או מוות עצבי הנגרם על-פגיעה במערכת העצבים.

גורמי neurotrophic חיוניים לצמיחה והישרדות של תאי עצב בפיתוח, כמו גם תחזוקה ופלסטיות של נוירונים בוגרים. מספר המחקרים הראו תפקידים משמעותיים של גורמי neurotrophic בקידום צמיחה והתמיינות ראשוניות של תאי עצב במערכת העצבים המרכזית והיקפית (CNS וPNS) והם יכולים גם לעורר התחדשות במבחנה ובמודלים nimal של פגיעה עצבית ^1. גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF) בא לידי ביטוי ביותר במערכת העצבים המרכזית והיא ממלאת תפקידים חשובים בויסות התפתחות עצבית, פלסטיות הסינפטית ותיקון ^2. תא גלייה גורם neurotrophic (GDNF) המופק מקו מקדם הישרדות של סוגים רבים של תאי עצב הכוללים דופאמין וmotorneurons ^3. לפיכך, אסטרטגיה חשובה לתיקון עצבי היא לספק מקורות אקסוגניים של גורמי neurotrophic לאזורים הפגועים או חולים של מערכת העצבים.

תאי עצם multipotent-נגזר מח גזע mesenchymal (MSCs) מחזיקים פוטנציאל גדול עבור משלוח של חלבונים תרופתיים לטיפול במערכת העצבים הפגועה או חולה. השתלה של תאי גזע משכה תשומת לב רבה במאמצים לפתח טיפולים מבוססי תאים תואמים מטופל כן יש להם מספר היתרונות כוללים, 1) קלות היחסית של בידוד ותחזוקה, 2) קיבולת multipotential, 3) חששות אתיים קטנים, 4) יכולת לשרוד ולהעביר לאחר השתלה ו -5) פוטנציאל להשתלה עצמית ^4,5. תוצאות מבטיחות כבר דיווחו עם שימוש בתאי גזע נאיבי ומהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים למספר תנאים ניווניות שונים, כוללים פגיעה בחוט השדרה ^6,7, שבץ ^8,9, המיאלין חסר ^10, וניוון רשתית ^11-13. צימוד השתלת תאים עם משלוח של גורמי neurotrophic מתאי גזע מהונדסים גנטי הוא רומן ואסטרטגיה תיקון עצבי חשובה.

צעד חיוני בפיתוח מערכות אספקת גורם טיפולי המבוסס על תאים הוא לקבוע את הבריאות הנורמלית של התאים המהונדסים. ככזה, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה להעריך פרמטרים צמיחה כלליים של תאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי. גישה חשובה להעריך במהירות פרמטרים תאים מרובים היא להעסיק screenin גבוה דרך תמונה מבוססת סלולאריg (HTS), המכונה לעתים קרובות הקרנת תוכן גבוהה כמו נהלים (HCS) ^14. טכנולוגיה זו מאפשרת רכישת תמונה אוטומטית וניתוח וגישה זו היא גם מתאימה במיוחד ליישומי מחקר בתאי גזע. בפרויקט זה פיתחנו פלטפורמה ליצירת פרופילים המאפשרת אפיון המהיר ואופטימיזציה של העדפות מצע תא ותפקודים תאיים בתאי גזע בוגרים מהונדסים גנטי המעסיקים מערכת HCS.

Protocol

1. הכנת תשתית לצלחות 96-היטב ליצור מפה של הצלחת 96-היטב המתארת את מצעים השונים ותא-סוגים להיבדק (איור 1). השג את מניית הפתרונות של מצעים שונים [poly-L- ליזין, פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, וIV-laminin entactin-קולגן (ECL)], צלחת ו96-היטב multiwell להכין תחנת עבודה בתרבית תאים סטריליים מכסה המנוע. הכן מצעים בודדים על ידי דילול מניות בפוספט סטרילי שנאגרו (PBS) לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מיליליטר (ריכוז זה נקבע בעבר על בסיס assay תלוי ריכוז מצע לצמיחה והתפשטות של תאים). מערבבים בעזרת מערבולת לפני המזיגה למאגר סטרילי. הוספה של פתרון מצע 100 μl היטב לתוך כל אחד על פי מפת 96-היטב (איור 1) (micropipette 12 או ערוץ 8-נוח לmicropipetting לתוך צלחת 96-היטב). לאטום את המכסה לצלחת 96-היטב באמצעות רצועה של Parafilm ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הדמיה ציפוי והזמן לשגות 2. תא הערה: עכבר MSCs היו מבודד ממוח העצם של מבוגרים C57BL / 6 עכברים ומתוחזק כקו תא חסיד. MSCs היו נגוע באמצעות וקטורי lentiviral להנדס אותם להפריש המופק במוח גורם neurotrophic (BDNF; cDNA אדם) וגורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה (GDNF; cDNA אדם) באמצעות של וקטור lentiviral BDNF (LV-BDNF קידוד; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), וירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). הערה: תקשורת תרבות לתאי גזע mesenchymal העכבר (MSCs) היא השינוי בינוני של Iscove של Dulbecco המכיל 10% בסרום hybridoma מוסמך שור עוברי, 10% בסרום סוסים, L-גלוטמין 2 מ"מ, ו10,000 U / פניצילין מיליליטר, 10 מ"ג / סטרפטומיצין מיליליטר . חמישה סוגים שונים של תאי גזע של עכבר (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-Mמאמנים וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופים בנקודת מפגש כ -30% בצלוחיות תרבית תאי T75. תא ציפוי ביום הבא, להסיר את פתרונות מצע על ידי שאיפה ולשטוף היטב כל אחד עם כ -200 μl של PBS סטרילי, פעמיים. הוסף מדיה תרבית תאים (200 μl / טוב) זה טוב אחרי שטיפת PBS הסופית. מניחים את צלחת 96-גם לתרבית תאי חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לאיזון. בעוד הצלחת 96-היטב היא equilibrating בחממה, לקצור את התאים (תאי גזע בצלוחיות T75 צריך להיות כ 70% ומחוברות בזמן קציר / ציפוי) על ידי איסוף תקשורת הצמיחה (המכונה בתקשורת מותנית כ) מהבקבוק T75 ו אחסון בצינור חרוטי 15 מיליליטר בתנאים סטריליים (תקשורת מותנית זה תשמש בשלב 2.1.4 להלן). הוסף 8 מיליליטר של PBS סטרילי לבקבוק ועדינות מערבולת ואז פיפטה את PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין 0.05% ושל 0.01%פתרון EDTA לנתק את התאים ממשטח התרבות של בקבוק T75. צג ניתוק תא על ידי צפייה בבקבוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת באופטיקה בניגוד שלב. כאשר התאים יש מנותקים, להוסיף באופן מיידי 8 מיליליטר של התקשורת המותנה (שנאסף בשלב 2.1.2) לבקבוק. אסוף את ההשעיה התא ולהעביר לצינור 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 450 XG לגלולת התאים. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 200 μl של טרי וחימם תקשורת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס). לקבוע את מספר התאים בהשעית התא על ידי ביצוע ספירת תאי trypan כחולה קיימא באמצעות hemocytometer. צלחת התאים בצפיפות של כ -300 תאים / גם לתוך הבארות המתאימות של 96 גם הצלחת. חזור על שלבים אלה עבור כל אוכלוסייה של תאים. זמן לשגות הדמיה ברגע שכל MSCs כבר מצופה, מקוםצלחת 96-היטב לחממה עבור שעה 2 כדי לאפשר לMSCs לצרף המצע. להפעיל את מערכת HCS ולהמתין לשעה 2 למערכת כדי לאזן. הגדר את בקר הסביבתי עד 37 מעלות צלזיוס ולהתחבר בלון גז מעורב המכיל 5% CO 2 באוויר לתא הסביבתי מערכת HCS אספקת מקור אוויר קבוע. הסר את הצלחת 96-היטב מן החממה לאחר תקופת איזון שעה 2 ומקום ישירות לתוך תא צמיחת תאים של מערכת HCS. לאפשר 30 דקות לאיזון לדין וחשבון על כל הרחבה הקשורות לחום של הצלחת ולאחר מכן להפעיל את תוכנת רכישת תמונה וניתוח כדי לקבוע את הגדרות הצלחת. בחר את מטרת 20X להדמיה. בחר שתי בארות לכל מצב [כלומר, GFP-MSCs על פיברונקטין וכו '(6 מצעים x 5 תת MSC עבור הסכום כולל של 30 תנאים x 2 משכפל = 60 בארות בסך הכל)] להקמת הדמיה הזמן לשגות. בחר שני אתרים להדמיה עםבכל טוב. בחר אורכי גל האור הנכונים להדמיה. הערה: שני אורכי גל שונים (בניגוד שלב וקרינת GFP), שנבחרו לזמן לשגות הדמיה. להתמקד בתחתית גם באמצעות פוקוס אוטומטי לייזר ולקחת תמונות מבחן למספר רבים של אתרים ובארות רבות למצוא מישור מוקד מותאם. ברגע שהמוקד כבר נקבע, להתחיל בלכידת תמונות כל 5 דקות במשך 48 שעות לכל 60 בארות (120 אתרים). להאכיל את התאים בכל שעה 24 על ידי הסרת הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. הסר 75 μl של תקשורת מכל טוב ולהוסיף תקשורת טרי 100 μl היטב כל אחד (לאזן תקשורת טרי זה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). בסופו של ניסוי הזמן לשגות, להסיר את הצלחת 96-היטב ממערכת HCS. בתנאים סטריליים, לאסוף דגימות התקשורת המותנות מכל טוב ולהעביר דגימות אלה למשנהו צלחת 96-היטב. הערה: דגימות אלה יכולים לשמש לanalys נוסףהוא על ידי ביצוע ELISA לגורמי neurotrophic. הכן את צלחת 96-היטב עם MSCs התרבותי למבחנים נוספים, כגון assay התפשטות תאי Ki67 או יודיד propidium החי assay צביעה מת / (ראה פירוט בהמשך). לבצע ניתוח הזמן לשגות הדמיה למעקב הגירה / תא תא כאמור בסעיף 5 להלן. התפשטות תאי 3. Ki67 ויודיד Propidium Live / Assay המלח Cell Ki67 הפצת הנשק Assay (Immunocytochemistry) יש לשטוף את תרביות תאים עם 0.1 פוספט M (4 PO) חיץ לרגע אחד שתי פעמים. תקן את התרבות עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף את הבארות עם PBS במשך שבע דקות, שלוש פעמים. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף פתרון של חוסם 100 μl (מלוח חיץ פוספט, 5% בסרום חמור רגיל, 0.4% בסרום אלבומין שור, ו -0.2% Triton X-100) לכל אחד גםnd דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. הכן את הנוגדן הראשוני, ארנב נגד Ki67, על ידי דילול בפתרון חוסם ביחס עבודה של 1: 200. הסר את הפתרון חוסם וליישם את פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl היטב כל אחד. מכסה את צלחת 96-היטב דגירה הדגימות ב 4 ° C למשך הלילה. ביום הבא, להסיר את פתרון הנוגדן ולשטוף עם PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. הכן את הנוגדנים משני, חמור נגד הארנב Cy3 בחסימת פתרון ביחס עבודה של 1: 500. להוסיף כתם גרעיני DAPI לפתרון נוגדנים משני בדילול של 1: 100. לאחר הסרת שטיפת PBS האחרונה, חל מפתרון הנוגדן / DAPI המשני לכל 100 μl היטב. דגירה בטמפרטורת חדר בחושך במשך 90 דקות. הסר את הנוגדן / פתרון DAPI המשני ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. Propidium יודיד Live / Assay המלח למדוד מוות של תאים על ידי יודיד propidium assay הדרה (PI) כפי שיתואר להלן. הכן את פתרון כתם יודיד propidium בריכוז של 1.5 מיקרומטר בתקשורת ובתרבות. הוספה של 70% אתנול 100 μl ולאחת מMSCs 2 דקות עם הכוונה להרוג תאים אלה. גם זה משמש כביקורת חיובית לכתם לצרכן. רוב MSCs יהיה המציין מוות של תאים מוכתמים PI. הסר את פתרון אתנול. הוספה של פתרון כתם יודיד propidium 100 μl לכל היטב דגירה במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. יש לשטוף את התאים עם חיץ פוספט 0.1 M דקות 1, 2 פעמים. תקן את התאים עם 4% PFA ב 0.1 חיץ M P0 4 במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את PFA ולשטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 7 דקות. דגירה עם פתרון DAPI (01:50) בדילול מלא בפתרון חוסם עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. יש לשטוף את כל הבארות עםPBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. הסר את פתרון DAPI ולשטוף היטב עם כל PBS במשך 7 דקות, 3 פעמים. מכסה את צלחת 96-היטב ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה. ניתוח 4. אוטומטי הדמיה וMultiwavelength ניקוד לטעון צלחת 96-היטב (מעובד בעבר עבור immunolabeling Ki67 או מוכתם יודיד propidium) למערכת HCS ולאפשר את הצלחת לאזן במשך 20 דקות פתחו את תוכנת רכישת תמונת מערכת וניתוח HCS. בחר את הגדרות רכישה למטרת 10X באמצעות המצלמה binning ליום 1 ובהגדרת רווח של 2. מצא את Z-המטוס שבו התאים מתגוררים על ידי ניצול פונקצית החשיפה האוטומטית ולחשב את הקיזוז לכל אורך גל של עניין. בניתוח זה, ללכוד תמונות לDAPI (W1), Cy3 (W2), וFITC (W3). בחר את רמת העצמה המקסימלית שבבארות השליטה השליליות להראות שום אות לרכישת תמונה. לאשר הגדרה זו מתאים לקופהבארות itive. לרכוש צלחת. צלם תמונות ולאחסן אותם ברכישת התמונה ותוכנה באתר של ניתוח. ברגע שתמונות נרכשו, תוכנת תמונה פתוחה רכישה וניתוח לא מקוונת וצלחת סקירת נתונים מהתמונות שנרכשו לעיל. בחר את ניתוח ניקוד Multi-גל. הגדר את המינימום ומקסימום עוצמות לכל אורך גל. הערה: זיהוי DAPI אמור לסמן את ההכתמה מסביב לכל גרעין גלוי. Cy3 אמור לזהות את התאים החיוביים עם immunoreactivity Ki67 (IR) ולא צריך לזהות IR תחת הבקרה השלילית. לCy3 Ki67 IR, הרוחב המינימאלי המשוער היה 7 מיקרומטר, רוחב מרבי משוער היה 30 מיקרומטר, העצמה מעל הרקע המקומי הייתה 150 רמות אפורות, ואת האזור המוכתם המינימאלי היה 50 מיקרומטר 2. ניתוח לרוץ לכל העמדות. לייצא את הנתונים כדי להציג בגיליון אלקטרוני. מעקב 5. תא acquisitio תמונה פתוחהn ותכנית ניתוח ולחץ על "נתונים פלייט הסקירה [DB] …", בחירת הצלחת של עניין. להציג את הנתונים כ" זמן לעומת ובכן ". בחר אחד מהאתרים מהמדור "האתרים" על ידי הקלקה על הבחירה הרצויה. בחר באפשרות "מועבר …" תחת "אורכי הגל:". לחץ לחיצה ימנית על היעד גם בתבנית צלחת 96-היטב ולחץ על "תמונות טען". עקוב אחר התאים על ידי לחיצה על "Apps" ולאחר מכן "אובייקטי מסלול". השתמש "Dynamic Data Exchange (DDE)" לבחור את הפורמט כדי לייצא את הנתונים, למשל, Microsoft Excel. בחר את נתוני מעקב ליצוא, למשל, זמן שחלף, מספר אובייקט, מרחק, מרווח זמן, מהירות, זווית מוחלטת, מרחק למקור, x ו- y דלתא הדלתא. לתייג כל תא של עניין עם "מקש Ctrl + לחיצה השמאלית" על תאי יעד. תאי מסלול. אם יש צורך, להפסיק / לשנות מעקב לא תקין של תאים עם המקש "Esc" ולאחר מכן להתאים את ההגדרות. לאחר מעקב התא הוא מלא, לשמור את הנתונים עם "יומן נתונים".

Representative Results

פרמטרים צמיחת MSC נבדקו על ידי culturing האוכלוסיות השונות של תאי גזע על מצעים שונים. חמש האוכלוסיות שונות של תת MSC (MSCs, GFP-MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs, וBDNF / GDNF-GFP-MSCs) היו מצופות לתוך צלחות 96-היטב בתרבית רקמה טרום מצופה עם שונה מצעים כפי שמודגמים באיור 1. לאחר ארבעה ימים של culturing, הצלחות קבועות וimmunolabeled ו / או מוכתמים בחומרים הכימיים המתאימים ולאחר מכן נבחנו באמצעות מערכת HCS וניתוחים שנערכו עם רכישת התמונה ותוכנת ניתוח תכנית. איור 1:. תבנית 96, גם צלחת לעיצוב ניסיוני 96-גם צלחות היו מצופים עם מצעים ובארות שונים היו זרע עם תאי גזע מהונדסים כפי שמוצגת בתבנית. כדוגמא, רק wells בBF שורות שימש בניסוי זה. שורות, G ו- H נותרו ריקים. קיצורים – MSCs: תאי גזע mesenchymal; GFP-MSCs: MSCs להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק; BDNF-GFP-MSCs: המוח נגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; GDNF-GFP-MSCs; גליה תא הנגזר MSCs גורם-להביע GFP neurotrophic; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; MSCs להביע GFP BDNF וGDNF-; ECL: Entactin-קולגן IV-Laminin). immunolabeling אנטי-Ki67, ואחריו counterstaining DAPI, שימש כדי להעריך אם מצעים השונים השפיעו על התפשטות של האוכלוסיות השונות של תאי גזע מהונדסים (איור 2 א). ביטוי של אנטיגן Ki67 מתרחש באופן מועדף בשלבים מאוחר 1 G, S, G 2 וM של מחזור התא, ולא זוהה בתאים בשלב המנוחה (G 0), ולכן הוא שימושי כסמן סלולארי להתפשטות 15 . 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא נו נפוץcounterstain ברור וכרומוזום שפולט הקרינה כחולה על מחייב לAT אזורים של DNA 16. המספר הכולל של תאים בתחום יכול להיקבע על ידי ספירת מספר גרעיני DAPI מוכתם. כפי שמודגם באיור 2, אם כי לא היה שינוי באחוזים של MSCs מתרבים, כל מצעים בכל זאת נתמך התפשטות תאים רבה לכל אחד מתת MSC. איור 2: assay התפשטות תאי Ki67. () מוזגו, תמונה כפולה ניאון של immunolabeling Ki67 (אדום) וDAPI מכתים גרעיני (כחול). רבים מMSCs היו immunolabeled עם נוגדן Ki67 (אדום). בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) גרף בר הממחיש את אחוזי Ki67 immunolabeled תת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגןהקלד אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעים (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. יודיד צביעת Propidium (PI) שימשה כדי להעריך אם מצעים שונים השפיעו על הישרדות תא (איור 3). יודיד Propidium הוא counterstain גרעיני וכרומוזום אדום-ניאון נפוץ. יודיד Propidium הוא impermeant קרום ובדרך כלל מתאי קיימא, ובכך הוא שימושי כדי לזהות תאים מתים באוכלוסייה. חלקם של תאים מתים בתוך מצב נתון ניתן לקבוע בשילוב עם תווית גרעינית כללית כגון DAPI לזהות את כל התאים בתוך שדה. אחוז תאי PI-החיובי היה נמוך בכל מצעים שנבדקו (איור 3). כביקורת חיובית למגיב PI, כמה בארות המכילות MSCs הודגרו באתנול 70%, מצב המכונה להרוג רוב התאים, וכתוצאה מכך אחוז גבוה של תאים שכותרתו PI כפי שמודגם באיור 3 ו3C (אתנול טופל חיובי שליטה). איור 3: assay המוות של תאי יודיד Propidium. () מוזגו, תמונת ניאון כפולה ליודיד propidium (אדום) וDAPI צביעה (כחולה). למרות שהגרעינים של כל תאי קיימא הוכתמו DAPI (כחול), לא מכתים יודיד propidium התגלה בMSCs. (B) כמעט כל MSCs היו מוכתמים ביודיד propidium בעקבות חשיפה לאתנול 70%. ברים בקנה מידה A ו- B = 100 מיקרומטר. תת סוג MSC (C) גרף בר הממחיש את האחוזים של יודיד propidium (PI) מוכתםs גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, אני, laminin, או IV-laminin entactin-קולגן מצעי סוג קולגן (ECL) במשך 5 ימים במבחנה (DIV). אתנול בקרה: מצב זה שימש כביקורת חיובית עבור מגיב מכתים לצרכן. רוב התאים נתון לטיפול באתנול כתם PI הבא מתים ובכך מוכתם באופן חיובי למגיב לצרכן. N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת ממוצעת של נתונים שנאספו מאתרים 8 צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. כדי לחקור את ההשפעה האפשרית של מצעים שונים על התנהגותם של תאי גזע מהונדסים, נדידת תאים נותחה באמצעות מערכת מועברת האור / הסביבתית הקאמרית במערכת HCS מיקרוסקופיה ודיגיטלית זמן לשגות (ראה וידאו נוסף 1). מספר אתרים / גם הם צילמו זמן לשגותומשמש לחישוב שיעורי נדידת תאים לאוכלוסיות השונות של תאי גזע גדלו על מצעים השונים באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. באופן כללי, כפי שמוצג באיור 4C, כל תת-הסוגים של תאי הגזע הראו שיעור ההגירה המהיר ביותר על פני השטח תאיים מצופה מטריצה (פיברונקטין, קולגן, Laminin וECL) והאיטיים ביותר על משטחי קלקר מצופים שאינם. איור 4:. מעקב סלולארי וההגירה MSCs מעקב עם רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. תמונות overlayed של משודרות תמונות אור וקרינה מ() תחילת הזמן לשגות הדמיה ו- (ב) בשעה 29 שעות מאוחר יותר בסוף פגישת ההדמיה הזמן לשגות (ראו וידאו נוסף 1). מסלולי נדידת תאים מסומנים על ידי li בצבע נס. בר סולם:. 50 גרף מיקרומטר בר (C) הממחיש את שיעורי הגירה הממוצע (המבוטא מיקרומטר / hr) לתת MSC גדל על פוליסטירן (PS), poly-L- ליזין (PLL), פיברונקטין, קולגן סוג אני, laminin, מצעים או IV-laminin entactin-קולגן (ECL) עבור 2 ימים במבחנה (DIV). N = ניסוי אחד. כל עמודה מייצגת הממוצעת של לפחות 10 תאים צילמו מ2 בארות עבור כל תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. יחדיו, תוצאות אלה מספקות ראיות ראשוניות לכך שאוכלוסיות של תאי גזע מהונדסים גנטי אלה להציג מאפייני צמיחה דומים. תוצאות אלה מספקות ראיות משכנעות לכך lentiviral בתיווך שינויים גנטיים של תאי הגזע אלה מושרה אין השפעות מזיקות לגילוי דרמטיות על הפרמטרים הצמיחה נחקרו תוך שימוש בפלטפורמת הקרנה זו. <p class= "Jove_content"> וידאו נוסף וידאו 1. זמן לשגות דיגיטלי של מעקב MSC באמצעות רכישת תמונה וניתוח התוכנה. נתיב הנדידה של לשני MSCs [מצויינים כמו 1 (קו ירוק מעקב) ו- 2 (קו הכחול מעקב)] מומחשים. וידאו שנתפס במשך תקופת 29 שעות. תמונות שנתפסו כל 5 דקות. תמונות הקרינה של MSCs להביע GFP שימשו לזמן לשגות הדמיה בהכנת הווידאו. בר כיול = 50 מיקרומטר. סוג זה של ניתוח הוא שימושי חוקר התנהגויות תא, כולל נדידת תאים וחלוקת תא.

Discussion

תאים בוגרים mesenchymal גזע (תאי גזע) הם סוג תא אטרקטיבי לפיתוח אסטרטגיה ניסיונית שילוב טיפול מסירה סלולארי וגן מבוסס. MSCs הוא multipotent, מסוגל להבדיל לתוך תאים של שושלת mesodermal, ולהציג גמישות רבה, הבחנה / transdifferentiating לשושלות עצביות וגליה עם האינדוקציה המתאימה פרדיגמות ^17,18. יתר על כן, MSCs הושתל והוכח כיעיל במחקרים פרה-קליניים למספר ההפרעות, לרבות תנאים ניווניות ^19. היעילות הטיפולית של MSCs ידוע בשל אנטי-השגשוג מועיל, פעילות אנטי-דלקתית ואנטי-האפופטוזיס ^20. MSCs ידוע גם לייצר ולהפריש גורמי neurotrophic וצמיחה שונים, שסביר להניח תורמים לאיכויות neuroprotective הקשורים MSCs הנאיבי לאחר השתלה באתרים של פציעה או מחלה ^21. Importantly, MSCs ניתן מהונדס גנטי לאספקה רצופה של גורמי neurotrophic עבור יישומים מבוססי ריפוי גנטי סלולארי ומשולבים והיה בשימוש במספר המודלים של בעלי החיים של פציעה או מחלה ^ל11,19,22 CNS.

בפיתוח אסטרטגיה המבוססת על טיפול תאי וגנטי בשילוב, חשובה שבריאותם של התאים מוערכת בזהירות, ובמיוחד בלפני השימוש הנרחב שלהם במבחנת יישומי vivo. כהוכחה של מושג, שחקרנו אוכלוסיות מרובות של קווים מהונדסים וMSC שליטה כדי ללמוד את ההשלכות של השינויים הגנטיים על בריאות תא וכושר באמצעות גישת הקרנת תוכן גבוהה (HCS). באופן כללי, HCS מתייחס להקרנת תפוקה גבוהה סלולרית מבוסס תמונה ^14. גישה זו מאפשרת הקרנת הערכה כמותית של פנוטיפים סלולריים במספר הרמות של מרחבי (תא subcellular) ובזמן (אלפיות השניה לימים) מילolution פני תנאי ניסוי שונים. שימוש בגישה זו אנו ניגשים הבדלים אפשריים בהעדפת מצע על הפרמטרים הבאים: התפשטות תאים, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוות של תאים, ותנועתיות תא / הגירה. ניסויים תוכננו בפורמט צלחת תרבית תאי 96-היטב. בתוך צלחת אחת חקרנו באופן שגרתי הבדלים הקשורים למצע האפשר ביחס לכל אחד מפרמטרים לאוכלוסיות השונות של תאי MSC-transduced lentiviral והשוואת MSCs המהונדס עם המקורי MSCs, שאינו transduced. זה סיפק אמצעים כדי להשוות ישירות את התוצאות עבור תת-הסוגים השונים MSC עם סוללה של מבחני במבחנה כגון התפשטות תאים באמצעות immunolabeling Ki67, assay כדאיות תא חי / מת באמצעות מכתים יודיד propidium, והתנהגות תא על ידי ביצוע הדמיה דיגיטלית זמן לשגות . כשלוחה של HCS זה ניתן גם לבצע ELISAs על דגימות שנאספו מתקשורת מותנית w הבודדאמות כדי לקבוע כמותית הפרשה של גורמי neurotrophic. גם תקשורת אוויר מתת MSC שונה ניתן להשתמש במבחנת bioassays כדי לקבוע פעילות ביולוגית של גורמים מופרשים ^11,23. גם זה סוג של פלטפורמת HCS עשוי לשמש למדידות במבחנה של תולדת neurite מתרבויות עצביות עיקריות ושורות תאי גזע עצביות ^24. בסך הכל, התוצאות שלנו הראו כי תת-האוכלוסיות של תאי הגזע המהונדסים הגנטית המוצגות התנהגויות דומות בהשוואה לתאי הגזע מהונדס-אי. ההשפעה של מצעי תרבות מגוונים על צמיחת תאים ונדידת תאים לא הייתה שונה באופן דרמטי בין תת MSC, כמו גם מצעי תרבות. ככזה, מצעי המטריצה תאיים נבדקו לא הופיעו לשחק תפקיד קריטי בויסות היבטים של התנהגות תא אלה לMSCs המהונדס השונים הללו.

מחקר זה מדגים את השימוש במערכת HCS לניתוח בידולהיבטי t של התנהגות תא. עם זאת, אין זה נדיר להיתקל במגבלות הקשורות לניתוח תמונה. בהזדמנות, תוך ניתוח תמונות הקרינה, זה היה קצת קשה לקבוע את ערך הסף הנכון שמעליו immunolabeled או תאים מוכתמים יהיו נספר שכותרתו חיובית / מוכתם. לכן, כדי למזער את ההטיה סובייקטיבית, קביעת ערכי סף הייתה תלויה השוואה לבקרה (בקרה שלילית להדמית הקרינה בוצעו במקביל בכל העיבוד על ידי ההשמטה של הנוגדנים הראשוניים או משניים). מגבלה נוספת הייתה נתקלה במהלך הניתוח של נדידת תאים באמצעות הדמיה דיגיטלית לשגות-זמן. בחלק מהמקרים, תוכנת ההדמיה לא הייתה מסוגלת להבדיל בין התנועה בראונית האקראית של תא מול תא למעשה הנודד רק במרחק קצר מאוד. מגבלות נוספות ניכרו במצבים שבם תוכנת הניתוח לא הייתה מסוגלת להבחין בנוכחות של multipתאי le הסמוך מאוד לאחד אחר. כדי להתגבר על בחירת תא מדריך להגבלה נדרשה זה במהלך הניתוח ולא ניתוח אוטומטי לחלוטין. צפיפות ציפוי תא יכולה גם לגרום לעיקום נתוני נדידת תאים בין האוכלוסיות של תאים המציגים העדפה גדולה יותר לגדול בגושים לעומת תאים שגדלים בבידוד זה מזה. הבדלים אלו סוגים בחלק סביר השתקפות של תא-מצע לעומת העדפות תאי תאים.

שימוש במערכת HCS לרכוש תמונות ולבצע ניתוח נתונים מספקת אמצעי יעיל ומהיר על מנת להעריך פרמטרים תאים מרובים. בנוסף, קטעי וידאו דיגיטליים הזמן לשגות במשך 30 תנאים שונים (6 מצעים ו 5 תת MSC שונה) נרכשו באופן שיגרתי לתקופות הנעות בין שעות עד ימים (48 שעות) בעת השימוש בתא הסביבתי. נתונים אלה היו לאחר מכן שימשו לחישוב ולקבוע הבדלים בשיעורי נדידת תאים על פני שורות תאים שונות בECM שונהמולקולות.

בדוח זה אנו מדגישים את היישום של פלטפורמת הקרנת תוכן גבוהה כדי להעריך את בריאות תא ותפקודו. סוג זה של ניתוח הוא שימושי לפיתוח אסטרטגיות הגיוניות לעיצוב תא-סוגים, כמו גם מצעי פולימר כדי להקל על צמיחת תאים ביימה והתחדשות עצבית. זהו צעד חיוני לקראת יישום של משלוח מבוסס תאי גזע של גורמים טיפוליים לפני נרחב במחקרים פרה-קליניים vivo באמצעות אסטרטגיות השתלת תאים.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materials

96 well plates	Greiner Bio One	655090	96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody	Abcam (Cambridge, MA)	Ab16667	1:200 dilution
Collagen type I	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	C7661	Collagen from rat tail
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	711-165-152	1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin)	Millipore/Chemicon (Temecula, CA)	08-110
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Logan, UT)	SH30071.03
Equine serum	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
Ethanol	Chemistry Store (Ames, IA)	12003510	100%, 200 proof
Fibronectin	Fisher Scientific (Hampton, NH)	CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
KH₂PO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P285	For PO₄ buffer
K₂HPO₄	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	For PO₄ buffer
L-Glutamine	Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)	25030-081
Laminine (mouse)	Trevigen (Gaithersburg, MD)	3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice	Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)		Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)	These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	4% PFA in 0.1M PO₄ buffer
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P0781
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4707
Propidium iodide (PI)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	P1304MP
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1X)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Invitrogen (Carlsbad, CA)	12440–046
Hybridoma-qualified FBS	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
Equine serum	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
ImageXpress Micro	Molecular devices (Sunnyvale, CA)	ImageXpress micro	High content screening system
MetaXpress 4.0	Molecular devices (Sunnyvale, CA)	MetaXpress 4.0	Image acquisition and analysis software

Referanslar

Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats–similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson’s disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

Etiketler

Mesenchymal Stem Cells Genetic Modification Brain-derived Neurotrophic Factor Glial Cell-derived Neurotrophic Factor High Content Screening Cell Adhesion Cell Proliferation Cell Migration Cell Viability Neuroprotective Strategies

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Sharma, A. D., Brodskiy, P. A., Petersen, E. M., Dagdeviren, M., Ye, E., Mallapragada, S. K., Sakaguchi, D. High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies. J. Vis. Exp. (95), e52242, doi:10.3791/52242 (2015).