<em> Ex Vivo</em> Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Вырождение аксонов из основных причин заболеваемости охватывающих несколько неврологических заболеваний, включая нейротравме, инсульта, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. В отличие от периферической нервной системы (ПНС), центральной нервной системы (ЦНС) аксоны имеют ограниченные возможности к регенерации однажды ранил из-за как внутренних, так и внешних барьеров (например, тормозные молекул рост аксонов, образующихся при формировании рубцовой и выделяющейся при миелиновой дегенерации) ^{1 -7.} Хотя некоторые из этих барьеров были широко изучены, терапевтические мероприятия, направленные на предотвращения ЦНС дегенерацию аксонов, способствуют надежной регенерацию аксонов, и восстановить функциональную соединительно, остаются ограниченными.

Аксоны После отделения от их сомы пройти стереотипное процесс перерождения известного как валлеровский дегенерации, которая характеризуется аксонов отек, сфероида образования и в конечном итоге фрагментации (обзор ^8). Вконтраст, проксимальный культи, что остается в непрерывности с сомы о пересечённого периферической аксона, формирует отек на его конце, отмирает до ближайшей перехвата Ранвье, а затем может инициировать образование роста конуса, жизненно необходимым условием необходимым для последующей регенерации аксонов ^9-11. В отличие от этого, проксимальные аксонов окончаний многих центральных аксонов образуют характерные "endbulbs" или луковицы отвода не образуют конусы роста, и вместо того, чтобы убрать от места повреждения, где они остаются в течение нескольких месяцев после травмы ^12-15. В дополнение к основной аксонов травмы, дополнительное повреждение аксонов / потери могут также происходить в аксонов, которые были в значительной степени избавлены от начальной травмы. Это задержка аксонов потери изначально избавлены аксонов называют вторичной дегенерации аксонов. Это неотъемлемое ответ ЦНС аксонов травмы оказывает функциональных регенерации аксонов еще более труднодостижимой целью достижения в головном и спинном мозге.

Хотя гаllmarks аксонов травмы (например, сфероида образования, луковицы отвода) были охарактеризованы с посмертной ткани и экспериментальных моделей дегенерации аксонов, выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих динамических процессов была ограничена. Большинство этих исследований использовали такие статические конечных наблюдений, которые по своей сути не смогли захватить отдельные аксонов ответов с течением времени. Хотя экзогенно применяется аксонов индикаторы оказались полезными для выяснения ответов аксонов от статических разделов и во время живого изображения, наличие генетически кодируемых аксонов маркеров значительно улучшили нашу способность визуализировать аксоны в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Действительно, основополагающем докладе от Kerschensteiner и коллег-первых условии прямых доказательств дегенерации аксонов и регенерацию в естественных условиях с использованием Thy1 -GFP-S мышей, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок в подмножеств нейронов, которые посылают свои прогнозы в спинной колонкам позвоночникашнур ^16. Живая съемка подходов с использованием двух фотонных лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) и генетических флуоресцентный белок маркировки клеток, представляющих интерес продолжает оказывать прямое доказательство и механических понимание многих различных динамических процессов, таких как дегенерации аксонов, Ca ²⁺ сигнализации, регенерации аксонов, астроцитов физиологии, микроглии физиологии и ответ на повреждение ^17-25.

В отличие от аксонов, очень мало известно ответов миелиновых травмы в режиме реального времени. Миелин является жизненно важным компонентом белого вещества создан и поддерживается олигодендроцитах в клетках ЦНС и Шванновских в ПНС. Миелин изолирует 99% поверхности аксонов и тем самым обеспечивает высокую сопротивления, малой емкости защитное покрытие, которое поддерживает быстрое и эффективное Сальтаторные распространение импульса, недавно рассматривался Buttermore и др. ^26. Чтобы захватить динамические характеристики миелина на повреждение, мы используем сольватохромные, липофильныхфлуоресцентный краситель Нила Red ^27. Сольватохромных свойства этого витальной окраски позволяют спектральные сдвиги его спектра излучения, которая зависит от физико-химической среде ^28,29. Эти свойства полезны, чтобы разобраться в механизмах axomyelinic травмы и может быть визуализированы с помощью соответствующим образом выбранных дихроичными и фильтры выбросов или разрешено с помощью спектрального микроскопа ^27. Например, спектр излучения Найл Ред является сине-смещается в менее полярных липидов богатых средах, таких как те, что в адипоцитах и нормальной миелина ЦНС (максимум излучения ~ 580-590 нм) ^27. В отличие от этого, пики спектра излучения этой жизненно важной красителя по крайней ~ 625 нм endbulbs, образующихся в аксонов подвергаются аксонов отмирание ^27. Хотя точные механизмы, лежащие в основе этих спектральных сдвигов в частности, в endbulbs по сравнению с нормальной миелина остаются неясными, такие спектральные изменения могут выявить основные изменения в накоплении белка или дезорганизации, ведущего квоздействие гидрофобных сайтов связывания ^27.

В то время как изображения в естественных это конечная метрика для наблюдения спинного мозга динамику аксонов травмы в их родной среде, это технически сложным и требует значительных хирургического опыта, и часто повторяют операции, чтобы разоблачить спинной колонки, которые могут представить экспериментальные артефакты (например, воспаление рубцовой формирование). Кроме того, дорогостоящего оборудования часто требуется, чтобы подвески и позиционирование интактного животного под микроскопом объектива. Животные должны быть тщательно проверены, а чтобы они оставались теплыми, чтобы обеспечить жидкости пополняется, и гарантировать, что нет никаких признаков гипоксии из-за длительного наркозом сессий визуализации. Последнее чрезвычайно важно, так как аксоны и миелиновых абсолютно требует постоянного перфузии и адекватные уровни кислорода, чтобы оставаться жизнеспособными. Тем не менее, это часто не сообщается или контролируются в наиболее естественных условиях исследования вДата. Кроме того, артефакты движения из-за сердечного ритма и дыхания (ИФ анестезии взрослой мыши: ~ 300-450 ударов в минуту (BPM) является оптимальным для поддержания 97-98% насыщения кислородом (нормальная скорость ~ 632 BPM) и ~ 55-65 вдохов в мин (нормальная скорость составляет ~ 163 вдохов в минуту), соответственно)) ³⁰ столкнулись во время в естественных условиях спинного марки изображений шнур дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы при высоком разрешении флуоресцентной микроскопии трудно, так как даже самые быстрые лазерного сканирования неизбежно подчиняются этим движением артефакты. Успехи в сверхбыстрых резонансных сканеров в сочетании с имплантируемого твердого позвоночника в рамке окна может позволить визуализации мышиного спинного мозга у бодрствующих животных, но раз быстрее сканирования неизбежно уменьшить отношение сигнал-шум качество изображения унижающие. Дальнейшие улучшения в методах визуализации спинного мозга, в настоящее время используются для визуализации головного мозга может преодолеть многие из этих препятствий и ограничить потенциальные смешивает вносимые INAdequate тканевой перфузии, например, ^31-33.

Многое из того, что известно о белого вещества физиологии и механизмов белого травмы вещества была определена с использованием в пробирке или бывших естественных препаратов белого вещества из зрительного нерва, периферического нерва, и полоски спинного мозга белом веществе ^34-41. Эти препараты продолжают продвигать наши знания о белых механизмов травмы от того, как они позволяют контролируются изменения в экологических факторов, контролируемое применение лекарственных препаратов и реагентов, функциональные оценок с использованием электрофизиологии, а прямые флуоресцентной микроскопии наблюдения аксонов и миелина в живой ткани. Тем не менее, некоторые прежние подходы наблюдать аксоны от спинного мозга полос спинной колонки или брюшной полос белого вещества неизбежно травмировать поверхности аксонов на стадии удаления, которые могут повлиять на реакцию тесно отличие аксонов. Чтобы воспользоваться экспериментальными манипуляции над и избежать повреждения веRy волокна под следствием, мы используем Экс Vivo шейного отдела спинного модель мозга, так как предотвращает непосредственный контакт спинной части мозга. Таким образом, архитектура мягкой мозговой оболочки и прилегающих поверхностной дорсальной аксонов столбцов остаются жизнеспособными и невозмутимо во время изоляции.

Здесь мы описываем относительно простой подход, который позволяет непосредственно наблюдать центральных миелиновых аксонов, как они динамически реагировать на фокальной травмы в режиме реального времени до 8 – 10 + часов после травмы. Травмы спинного мозга (Lisci) модель лазерно-индуцированной позволяет дифференцировать между первичными и вторичными механизмов аксонов травмы, первичное поражение (абляции сайта) остается пространственно ограниченных во времени. Изображения камеры открытым ванна доступна терапевтического вмешательства, доставка реагентов и экологических манипуляций. Предполагаемые axomyelinic защитные агенты могут быть быстро оценены в реальном времени с помощью прямых наблюдений по сравнению с длительных и дорогостоящих экспериментов, связанных с процессом тканейING, секционирования, иммуноокрашивания, захват изображения, и анализ, и, следовательно, обеспечивает полезную суррогатной модели для оценки острых ответов и защитные манипуляции перед тестированием экспериментальные агентов в живых животных.