Um<em> Ex Vivo</em> Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

A degeneração de axônios é uma causa importante de morbidade abrangendo várias condições neurológicas, incluindo neurotrauma, acidente vascular cerebral, auto-imune, e doenças neurodegenerativas. Ao contrário do sistema nervoso periférico (SNP), sistema nervoso central (SNC) axónios têm uma capacidade limitada para se regenerar uma vez feridas devido a ambas as barreiras intrínsecos e extrínsecos (isto é, moléculas inibidoras do crescimento axonal produzido durante a formação de cicatriz e libertado durante a degeneração da mielina) ^{1 -7.} Embora várias dessas barreiras foram amplamente exploradas, intervenções terapêuticas destinadas a prevenir a degeneração axonal CNS, promover a regeneração axonal robusta, e restaurar connectively funcional, permanecem limitados.

Axónios uma vez separados do soma passam por um processo de degeneração estereotipada conhecida como degeneração Wallerina que é caracterizado pela presença de edema axonal, formação esferóide fragmentação e eventual (revistos em ^8). Emcontraste, o coto proximal que permanece em continuidade com a soma de um axônio periférico seccionado, forma um inchaço no seu fim, morre de volta ao nó mais próximo de Ranvier, e pode, então, iniciar o crescimento do cone formação, um pré-requisito vital necessário para posterior regeneração axonal ^9-11. Em contraste, as terminações axonais proximais dos axónios muitas centrais formam característicos "endbulbs" ou lâmpadas de retracção, não conseguem formar cones de crescimento, e em vez retrair para longe do local da lesão, onde permanecem durante meses após a lesão ^12-15. Além da lesão axonal primária, axonal dano / perda adicional também pode ocorrer a axônios que foram em grande parte poupadas da lesão inicial. Esta perda axonal atrasado de axônios inicialmente poupado é referida à degeneração axonal como secundário. Esta resposta inerente de axônios do SNC a lesão torna a regeneração axonal funcional uma meta ainda mais difícil de conseguir no cérebro e na medula espinhal.

Embora hallmarks de lesão axonal (por exemplo, a formação de esferóide, lâmpadas de retração) foram bem caracterizados a partir de tecido post-mortem e modelos experimentais de degeneração axonal, elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes a esses processos dinâmicos foi restringido. A maioria desses estudos se baseou em observações ponto final estático que, inerentemente, não conseguiu captar respostas axonal individuais ao longo do tempo. Embora exogenamente aplicado marcadores axonais ter sido útil para elucidar respostas axonal das seções estáticas e durante o exame ao vivo, a disponibilidade de marcadores axonais geneticamente codificados tem melhorado muito a nossa capacidade de visualizar os axônios em tempo real por meio de microscopia de fluorescência. De fato, um relatório seminal de Kerschensteiner e colegas fornecida primeira evidência direta de degeneração axonal e regeneração in vivo utilizando camundongos Thy1 -GFP-S que codificam a proteína verde fluorescente em subconjuntos de neurônios que enviam suas projeções nas colunas dorsais da medulacabo de ^16. Imagens ao vivo abordagens por microscopia de varredura a laser photon dois (TPLSM) e rotulagem proteína fluorescente genético das células de interesse continua a fornecer evidências diretas e visão mecanicista em muitas e diversas processos dinâmicos como a degeneração axonal, Ca ²⁺ sinalização, a regeneração axonal, fisiologia astrócitos, fisiologia microglial, e resposta à lesão ^17-25.

Em contraste com os axónios, muito pouco se sabe sobre as respostas à lesão da mielina em tempo real. A mielina é um componente vital da matéria branca produzido e mantido por oligodendrócitos nas células do SNC e de Schwann no PNS. Mielina protege 99% da superfície de axônios e fazendo assim fornece uma alta resistência, revestimento protector baixa capacitância que suporta propagação do impulso saltatory rápida e eficiente, recentemente revisado por Buttermore et al. ^26. Para capturar a resposta dinâmica da mielina a lesão usamos o solvatocrômico, lipofílicocorante fluorescente Vermelho de Nilo ^27. As propriedades solvatocrômicos deste corante vital permitir mudanças de espectro de seu espectro de emissão que é dependente do ambiente físico-química ^28,29. Estas propriedades são úteis para obter insights sobre os mecanismos de lesão axomyelinic e pode ser visualizada usando dichroics devidamente seleccionados, filtros de emissão ou resolvidos usando microscopia espectral ^27. Por exemplo, o espectro de emissão do vermelho do Nilo é azul-deslocada em ambientes ricos em lípidos menos polares, tais como aqueles encontrados nos adipócitos e mielina do SNC normal (pico de emissão ~ 580-590 nm) ^27. Em contraste, o espectro da emissão deste corante vital em ~ 625 nm em endbulbs formados como axônios passam por perecimento axonal ^27. Embora os mecanismos precisos subjacentes a estas mudanças de espectro especificamente em endbulbs contra mielina normais permanecem obscuros, tais mudanças espectrais pode revelar alterações subjacentes na acumulação de proteínas ou desorganização levando aexposição de sítios de ligação hidrofóbicos ^27.

Enquanto a imagem in vivo é a métrica final para observar medula espinhal dinâmica lesão axonal em seu ambiente nativo, é tecnicamente desafiador e requer perícia cirúrgica substancial, e muitas vezes repetir cirurgias para expor a coluna dorsal que pode introduzir artefatos experimentais (por exemplo, inflamação e cicatriz formação). Além disso, o equipamento caro é muitas vezes necessário para permitir que a suspensão e o posicionamento de um animal intacto sob a lente objectiva de microscópio. Os animais devem ser cuidadosamente monitorados, bem como para garantir que eles permaneçam quentes, para garantir fluidos são reabastecidos, e para garantir que não há sinais de hipóxia por sessões de imagem anestesiados prolongados. Este último é extremamente importante como axónios e mielina requerem absolutamente constante de perfusão e os níveis de oxigénio adequados para permanecerem viáveis. No entanto, isso muitas vezes não é relatado ou monitorados em mais estudos in vivo paradata. Além disso, os artefatos de movimento, devido à freqüência cardíaca e respiração (anestesia inalatória adulto mouse: ~ 300-450 batimentos por minuto (BPM) é ideal para manter a 97-98% de saturação de oxigênio (normal taxa de ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respirações por min (taxa normal é de ~ 163 respirações por minuto), respectivamente)) ³⁰ encontrados durante in vivo espinhal make imaging cabo diferenciar respostas lesão axonal primário e secundário, através de microscopia de fluorescência alta resolução desafio, até mesmo as varreduras a laser mais rápidos inevitavelmente estão sujeitas a estes movimentos artefatos. Avanços na ultra-rápidos scanners de ressonância combinados com uma janela vertebral rígida implantável enquadrado pode permitir imaging da medula espinhal murino em animais acordados, mas os tempos mais rápidos de digitalização inevitavelmente reduzir a relação sinal-ruído qualidade de imagem degradante. Outras melhorias nas técnicas de imagem da medula espinhal como actualmente utilizados para exames de imagem cerebral pode superar muitos desses obstáculos e limitar os potenciais fatores de confusão introduzidas pela inaperfusão tecidual dequate, por exemplo, ^31-33.

Muito do que se sabe sobre a fisiologia da substância branca e mecanismos de lesão substância branca foi determinado utilizando in vitro ou ex vivo preparações de substância branca do nervo óptico, nervo periférico, e as tiras de medula espinhal substância branca ^34-41. Estas preparações continuar a aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de lesão da substância branca como eles permitem variações dos fatores ambientais, a aplicação controlada de medicamentos e reagentes, avaliações funcionais usando eletrofisiologia, e observações diretas microscopia de fluorescência dos axônios e mielina em tecidos vivos controlada. No entanto, algumas abordagens anteriores para observar axônios de cordão espinhal tiras de coluna dorsal ou tiras de substância branca ventral inevitavelmente ferir axônios de superfície durante a fase de remoção que pode influenciar a resposta dos axônios de perto opostos. Para capitalizar sobre as manipulações experimentais acima e evitar danos ao vefibras ry sob investigação, utilizamos um modelo da medula espinhal cervical ex vivo em que evita o contato direto do aspecto dorsal da medula. Assim, a arquitetura da pia-máter e axônios da coluna dorsal superficial adjacentes permanecem viáveis ​​e imperturbável durante o isolamento.

Aqui nós descrevemos uma abordagem relativamente simples, que permite a visualização direta de axônios mielinizados centrais como eles respondem dinamicamente a uma lesão focal em tempo real até 8 – 10+ horas após a lesão. A lesão medular modelo induzido por laser (Lisci) permite a diferenciação entre os mecanismos de lesão axonal primário e secundário como a lesão primária (local de ablação) permanece espacialmente restritos ao longo do tempo. A câmara de imagem-banho aberto é acessível a intervenção terapêutica, de fornecimento de reagentes, e manipulações ambientais. Agentes protetores axomyelinic putativos pode ser rapidamente avaliado em tempo real através de observações diretas contra experiências longas e custosas que envolvam processo tecidoing, seccionamento, immunostaining, captura de imagem, e análise e, portanto, fornece um modelo substituto útil para avaliar as respostas agudas e manipulações de proteção antes de testar os agentes experimentais em animais vivos.