冲红灯光感受器原子力显微镜使用PeakForce定量纳米机械性能映射
Özet
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
原子力显微镜（AFM）使用连接到悬臂探测表面的力响应金字塔尖。尖端的偏转可以被测量到〜10 PN通过激光和扇区检测器，它可以转换为图像的形貌。振幅调制或“轻敲模式”AFM涉及制备与表面间歇性接触，在其谐振频率而振荡，以产生图像的探测器。用于与流体细胞结合，轻敲模式原子力显微镜使生物大分子的影像，如在生理条件有关的蛋白质。轻敲模式原子力显微镜需要的探头和多种可挑战经验的用户扫描参数的频繁调整的手动调整。为了获得高质量的图像，这些调整是最耗时的。
PeakForce定量纳米机械性能映射（PF-QNM）通过测量力respon产生图像本身曲线的每个点与样品接触的。与ScanAsyst软件，PF-QNM可以自动化。这个软件调整设定点，驱动频率，扫描速度，增益和其他重要的扫描参数自动给定的样本。这不仅处理同时保护脆弱的探针和样品，它显著降低，得到高清晰度的图像所需的时间。 PF-QNM是原子力显微镜成像流体兼容;因此，它具有用于成像的生物相关物质的广泛应用。
本文提出的方法描述PF-QNM的应用程序来获取细菌红光感光，RpBphP3（P3）的图像，从光合河沼泽红假单胞菌在其光适应状态。使用这种方法，P3的个别蛋白二聚体和二聚体的聚集体已经观察到在云母表面在成像缓冲器的存在。以适当调整表面和/或溶液浓度，这种方法通常可应用于其它生物学相关的大分子和软质材料。
Introduction
原子力显微镜（AFM）已成为自1986年发明（ 图1），调查表面，薄膜，和单个分子的结构和机械性能的非常重要的工具。1-3使用的液体芯，该方法具有成为在生物大分子的研究，即使活细胞是特别有用的生理学相关的环境。4-10轻敲模式原子力显微镜在传统上被用于成像软材料或松散结合的分子的表面，由于接触模式AFM通常是不合适的，由于由悬臂引起的横向力的损害作用在样品11攻牙模式AFM基本上由具有前端间歇触摸表面，而不是在恒定接触而减少了这些力。在这种模式下，悬臂摆动达到或接近其共振频率与表面垂直。同样地，以非接触式原子力显微镜模式，地势肛门通过绘制Z-压电的运动为XY（距离）的函数yzed。
悬臂动力学可以是相当不稳定的或接近共振;因此，他们是非常具有挑战性的自动化的“稳定状态”的情况外。具体地，这些动力学依赖于两个样品的性质和扫描环境。对于软分子吸附到硬盘（ER）的表面，经过良好调优的反馈回路的分子可能会导致反馈振荡的表面。操作在流体进一步复杂悬臂的调谐。温度变化或流体水平要求设定点，收益和其他成像参数的不断调整。这些调整往往是非常耗时和对用户的挑战性。
峰力定量纳米机械性能映射（PF-QNM），如轻敲模式原子力显微镜，通过样品（ 图2）间歇性地接触，避免了横向的互动。12-15 </ SUP>然而，PF-QNM工作在非谐振模式和频率比轻敲模式原子力显微镜低得多。这消除了轻敲模式原子力显微镜，特别是那些由流体的存在而加剧的调谐挑战。随着PF-QNM，图像通过采取武力响应曲线在每一个接触点收集。通过加入ScanAsyst软件，15调整扫描参数可被自动和高分辨率的图像由没有经验的用户获得在几分钟之内。一旦用户变得更加熟悉的原子力显微镜，任何自动或所有参数可以在任何时间，其允许实验者微调图像质量手动禁用。公司自成立以来，PF-QNM已经应用到地图细菌视紫红质，膜蛋白，以及其他天然蛋白在亚分子水平。16-18对细菌视紫红质，有弹性的蛋白质和X-射线晶体结构之间有直接的关系。12犯规-qnM的被利用来研究具有高分辨率的活细胞。19,20此外，PF-QNM数据已经阐明的红血球膜，这对细胞的完整性和功能是至关重要的内结构和力学之间的重要连接。21
我们已经采用扫描探针显微镜（SPM）的方法，22，包括原子力显微镜，23学习的红色光的光感受器的结构称为bacteriophytochromes（BphPs）。24,25它们由共价连接到信令执行器模块这样的光感测模块的因为组氨酸激酶（香港）26的光感测模组通常包含一个胆色素生色团，其在吸收光子发生结构转变，一系列深远的信号效应器模块，并导致整个蛋白质的全球转变的结构性变化，24,27-29基于这种转变，有两种截然不同的光吸收šBphPs，红色和远红外光吸收状态的美帝，表示为Pr和PFR。 Pr为热稳定的，暗适应状态下的最BphPs 28的PR / PFR光转化的分子基础是不完全是由于这些蛋白质的有限结构的知识的理解。随着从D除了一个结构球菌 ，这些蛋白质的30所有发表的X射线晶体结构是在暗适应状态下，缺乏效应器结构域。完整BphPs是太大而不能有效地通过核磁共振（NMR）研究，并且非常难以在其完整形式结晶（特别是在光适应状态下）的X射线晶体结构。 BphPs最近被改造为红外荧光蛋白标记（IFP的），这些蛋白31的结构特征可以进一步帮助有效IFP设计。32-36
本文的重点是介绍一个程序，影像通过PF-QNM使用液体电池的AFM BphPs的。该方法是从光合细菌R.表现在bacteriophytochrome RpBphP3（P3）的光适应状态下的学习沼泽 。这里介绍的AFM程序是用于蛋白质的成像方便和简单的方法，以及其他的生物大分子。用这种方法，单个分子的结构细节可以被收集的时间，类似于上位科学实验室课程会话短时间。通过测量断面，完成进一步的维分析，实验数据可以比较有效的计算模型。37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
原子力显微镜是一种扫描探针显微镜方法完全能够成像的蛋白质和其他生物大分子的生理相关条件。相比于X射线晶体学和核磁共振，原子力显微镜中的一个限制是它不能达到相同的分辨率，特别是横向分辨率。当使用原子力显微镜来分析在任何表面上的分子，该表面的分子的图象上造成的影响和探针也必须当数据进行分析考虑。所获取的图像上的探测器的影响去卷积可以用适当的软件来完成…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
美国国家科学基金会，MRI检查程序（CHE：1229103）被确认为购买新的电子控制装置，软件，液体电池，并装配了双AFM / STM所需的其他设备提供资金。我们承认在芝加哥NSF-MRSEC计划大学（DMR-0820054）与原子力显微镜仪器，培训和成像援助共用设施和仪器时提供的材料研究设施网络（DMR-0820054）。我们特别感谢泣涕郭医生，贾斯汀Jureller博士和嘉怡Lee教授为美国国家科学基金会，核磁共振建议，带来了必要的仪器，我们的校园资助之前，欢迎我们的学生。 （：P031C110157号）颁发给东北伊利诺伊大学所提供的暑期研究奖学金的学生和教师，以及支持消耗品我们承认，从第三章干补助资金。最后，我们感谢布鲁克纳公司的持续性支持和许可于reproduce剧情呈现PeakForce QNM的机制，用这个词ScanAsyst来形容自动化软件。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Yorumlar |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
Referanslar
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
