自动化芯片起实验产生上万HeLa细胞表观遗传配置文件

1.标准芯片实验细胞收集和DNA-蛋白质交联。 生长的HeLa-S3细胞的80％-90％汇合。除去培养基，用10ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）的洗碟两次，并添加胰蛋白酶-EDTA（1×）的培养板上。孵育最多2分钟，从培养皿分离细胞。收集细胞，并用10ml PBS洗涤两次。 注意：较长的培育时间会导致细胞损伤。 离心细胞5分钟，在500×g离心和重悬细胞于20ml PBS中。继续执行计数细胞。 离心细胞5分钟，在500×g离心，弃上清，加入500微升PBS中。细胞的固定步骤的最佳数量是每500微升PBS千万细胞。 添加13.5微升新鲜37％甲醛为500微升细胞悬浮液的各等分试样。固定的细胞在室温下8分钟。 添加57微升1.25M的甘氨酸SOLUT离子停止固定。孵育5分钟，在RT下持续混合通过温和涡旋。从这时开始上冰工作。 离心细胞，在500×g离心5分钟，在4℃并弃去上清液而不扰乱细胞沉淀。 用1毫升的PBS洗涤细胞两次。轻轻倒掉上清，保持细胞沉淀上冰。 细胞裂解和染色质剪切加入10毫升冰冷的裂解缓冲液IL1至细胞沉淀（1毫升每1百万细胞裂解缓冲液是最优比）。移液器上下几次并孵育10分钟，在4℃下温和混合。 离心裂解物5分钟，在500×g离心并4℃。弃去上清液。 加入10毫升冰冷的裂解缓冲液IL2的裂解物，并通过上下吹打轻轻混匀。孵育裂解物10分钟，在4℃下。 离心5分钟，在500×g离心，4℃，弃上清。 准备相再完全剪切缓冲器添加200X蛋白酶抑制剂混合物（PIC），该IS1剪切缓冲区。保持5分钟，在冰上的缓冲和事后在冰上工作。加入1毫升的完全IS1剪切缓冲器的每10万个细胞的颗粒和通过上下吹打轻轻混匀。在超声处理之前在冰上孵育样品10分钟，以降低样品的粘度。 使用水浴超声波仪为2至3组，每组10个循环剪切染色质的300微升等份通过超声处理。甲周期包括30秒“开”和在高功率设定30秒“关”。另外，使用一个皮超声处理装置用的30秒“开”，30秒“关”5至10个周期较短的超声处理时间。简要涡和自旋的运行之间的管子。当使用其他类型的sonicators，请按照相应的制造商的说明染色质剪切。 离心剪切染色质在16000×g离心10分钟，和collect要在IP步骤立即使用上清液。可替代地，存储所述染色质在-80℃下长达2个月以供将来使用。 分析染色质剪切效率，使用前1-1.5％TAE琼脂糖凝胶或bionalyzer免疫一步。最佳的染色质片段大小范围100-600基点之间。 2.低Cell芯片实验细胞收集和DNA-蛋白质交联生长的HeLa-S3细胞的80％-90％汇合。除去培养基，用10ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）的洗碟两次，并添加1×胰蛋白酶-EDTA到培养板上。孵育最多2分钟，从培养皿分离细胞。 注意：较长的培育时间会导致细胞损伤。 通过加入含有血清入1毫升离心管1毫升培养培养基收集细胞。计数细胞。 在500离心细胞5分钟×g下。使细胞数量到每毫升培养基中的固定的10,000个细胞。 加入27微升的36.5％新鲜准备甲醛到每个管固定。倒置该管两次或三次，并培育10分钟，在RT。 添加115微升1.25M的甘氨酸溶液于样品，颠倒试管两次或三次，并孵育5分钟，在室温。从这时开始上冰工作。 离心细胞，在300×g离心在4℃下10分钟。弃去上清液缓慢。 用1ml冰冷的HBSS事先知情同意（200X，终浓度1×）洗涤细胞。倒置该管两次或三次，在4℃至悬浮细胞和离心机在300×g离心10分钟。轻轻倒掉上清，保持细胞沉淀上冰。 细胞裂解和染色质剪切加入25微升的完全裂解缓冲液TL1（裂解缓冲液+ TL1 PIC），每10,000个细胞，并手动搅拌该管的底部，以悬浮细胞。在冰上孵育5分钟。 加入75微升完整的HBSS（HBSS + PIC）缓冲到含有10,000个细胞每等分。 剪切10,000个细胞通过超声处理将100μl等分试样进行5组，每组5周期。甲周期包括30秒“开”，并在高功率设定30秒“关”。或者，使用具有5个循环的30秒“开”，30秒“关”短超声处理时使用的微微超声处理装置。最佳的染色质片段大小范围100-600基点之间。需要注意的是染色质制剂，细胞类型和不同sonicators需要单独的剪切优化实验。 离心机以立即使用在IP步骤的剪切染色质以14000×g离心10分钟以弃去不溶性物质，并收集上清。可替代地，存储所述染色质在-80℃下长达2个月以供将来使用。 使用1-1.5％TAE琼脂糖凝胶分析染色质剪切效率前免疫沉淀步骤，或该bionalyzer。用RNase现有治疗样品琼脂糖凝胶分析，以提高剪切的视觉评估。最佳的染色质片段大小范围100-600基点之间。 3.染色质免疫沉淀和图书馆准备对于标准的自动化芯片实验加入120微升的ChIP缓冲H（沉淀缓冲H + PIC）的100微升剪切染色质。用200微升的IP，并保持2微升至20微升作为输入样本。 选择在自动化仪表自动化芯片200微升协议。吞吐量的协议为每运行1至16个样品。 运行使用自动化的ChIP实验，染色质相当于1-2万个细胞，1-2微克抗H3K79me3的，-H3K27me3，-H3K4me3，-H3K4me2，-H3K9ac，-H3K9 / 14ac，-H3K36me3和的H3K9me3芯片起级兔多克隆抗体。最优的抗体的量取决于在组蛋白修饰和亲和力和规格ificity相应的抗体。 使用的非免疫兔IgG等量作为同种型对照抗体。另外，使用无涂层的珠子或特定抗体阻断随着芯片控制。加入20微升的蛋白A包被磁珠每个反应。 使用自动组蛋白芯片起试剂盒进行自动化的芯片实验具有抗H3K79me3和-H3K4me2多克隆抗体。使用的理想芯片起试剂盒进行芯片实验具有抗H3K27me3，-H3K4me3，-H3K9ac，-H3K9 / 14ac，-H3K36me3和-H3K9me3。 选择自动化贴片协议下的自动化设备实现软件的说明。设置的ChIP实验参数以4小时为抗体涂覆步骤和15小时的免疫沉淀步骤。逆交联步骤发生在自动化仪器在65℃下4小时。 净化的自动化系统的反向的交联的DNA。选择AUTomated协议DNA纯化，协议或工具包利用磁珠基于DNA纯化。洗脱在25微升水中的DNA。 通过提取免疫沉淀的DNA的10％量化免疫沉淀的DNA。免疫沉淀的DNA量取决于染色质和抗体，细胞类型和目标组蛋白修饰的质量。量化，根据制造商的说明使用试剂盒的DNA中。 分析免疫沉淀的DNA使用引物至少1阳性和1个阴性对照的基因组区域的质量通过定量PCR。不用于评估的ChIP富集使用总免疫沉淀的DNA的10％以上。 准备定量PCR反应。加入10微升2倍SyberGreen的qPCR预混，1微升引物混合物，1-5微升的免疫沉淀或输入DNA和无菌水至20微升的最终反应体积。在定量PCR方案包括在95℃下初始变性步骤5-10分钟取决于Taq聚合酶的提供者和退火温度应根据所选择的引物进行设置。 使用自动化库准备协议与市售的Illumina芯片起文库制备试剂来构建同时使用的ChIP的DNA，以及由相同的染色质制剂中保存输入的DNA的库相兼容。用10-20纳克免疫沉淀DNA从每个抗体库的准备。准备高达每运行16自动库。 序库，并根据Illumina公司制造商的说明生成簇。进行一次生物信息学分析（集群过滤，基地通话等 ）按照标准Illumina的管道，过滤器和对准读取最新的人类基因组装配（当前版本是GRCh38）与ELAND对齐。使用SICER 7或8 MACS峰值呼叫并执行峰的下游分析瓦特第i荷马9，BEDTools 10或首选软件。 对于低格自动化数字芯片实验加入120微升的完整的​​ChIP缓冲TC1（芯片缓冲TC1 + PIC），以100微升剪切染色质。用200微升的IP，并保持20微升作为输入。 选择自动化系统自动化芯片200微升协议。吞吐量的协议为每运行1至16个样品。 使用自动化贴片试剂和芯片级的优化抗体上班质低量运行自动芯片起实验。使用染色对应于10,000个细胞和100,000个细胞，0.5微克抗H3K27me3的，0.25微克-H3K4me3，0.1微克-H3K27ac，0.25微克-H3K9me3兔高级芯片起级兔多克隆抗体。最优的抗体的量取决于在组蛋白修饰和相应的抗体的亲和力和特异性。 使用非免疫RAB等量位IgG作为同种型对照抗体。另外，使用无涂层的珠子或特定抗体阻断随着芯片控制。加入10微升蛋白A包被的磁珠每个反应。 选择自动化贴片协议下的自动化设备实现软件的说明。设置的ChIP实验参数以4小时为抗体涂覆步骤和15小时的免疫沉淀步骤。逆交联步骤发生在自动化仪器在65℃下4小时。 净化用离心柱按照生产商的说明，并从6微升在卷洗脱至25微升的水反向的交联的DNA。 量化使用市售测定试剂盒的DNA中。分析用引物对阳性和阴性对照区域的qPCR评估芯片质量的结果。 使用库制备试剂盒采用优化文库制备试剂制备低DNA全库tities。使用30 PG和PG 300的ChIP的DNA（分别对应1万元以上10细胞的实验）图书馆准备。准备使用自动化协议与文库制备试剂兼容库。自动库准备吞吐量为每运行1至48库。 下列的双链DNA模板的末端修复，结扎包含测序引物位点的裂解茎 – 环接头。下列的DNA延伸工序中，扩增与库中的制备试剂盒的协议描述的高保真扩增法的样品。 文库扩增后，量化和纯化后的文库制备试剂盒的指导方针的库。需要注意的是大小选择后纯化不是必要的。 序库，并根据制造商的说明生成簇。进行一次生物信息学分析（集群过滤，基地通话等 ）的立场如下ARD生产管线，过滤器，并对准读取到最新的人类基因组总成（目前的版本是GRCh38）与ELAND 7对准。使用SICER 8或9 MACS峰值呼叫，并以荷马执行峰的下游分析，BEDTools 10，或任何首选软件。 图1.屏幕截图，展示了如何设置自动芯片实验的IP-星紧凑的软件。该软件提供了灵活选择每次运行的样本量，以及变更的关键实验参数（抗体包，IP和洗涤）根据研究人员的需求。自动化过程允许测试并联不同条件（ 即 ，不同类型和抗体的量，不同类型和细胞的量，甚至不同吨ypes并在相同的运行磁珠金额。 请点击此处查看该图的放大版本。 图2.屏幕截图显示了如何使用该库套件在自动化系统中设置自动库准备下一代测序软件。 请点击此处查看该图的放大版本。