万HeLa細胞でエピジェネティックプロファイルを生成するためのChIP-seqの実験の自動化

1.標準ChIP実験細胞収集及びDNA-タンパク質架橋。 80パーセント-90％の合流点にしたHeLa-S3細胞を成長させる。培養培地を除去する1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで二回皿を洗い、そして培養プレートをトリプシン-EDTA（1×）を加える。皿から細胞を剥離するために2分の最大インキュベートする。細胞を収集し、10ミリリットルPBSで2回洗浄します。 注：より長いインキュベーション時間は、細胞損傷につながる。 500×gで5分間、細胞を遠心分離し、PBS 20ml中で細胞を再懸濁する。細胞を数えるに進みます。 、500×gで5分間、細胞を遠心上清を破棄し、500μlのPBSを追加。固定工程のための細胞の最適数は、PBSを500μl当たり10万個の細胞である。 細胞懸濁液を500μlの各アリコートに新鮮な37％ホルムアルデヒドの13.5を添加する。室温で8分間、細胞を固定する。 1.25 Mグリシンsolutの57μLを追加固定を停止するイオン。穏やかなボルテックスにより一定に混合しながら室温で5分間インキュベートする。以降、この点から、氷上での作業。 4℃で5分間500×gで細胞を遠心し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を捨てる。 1mlのPBSで細胞を2回洗浄する。優しく上清を捨て、氷の上で細胞ペレットを保つ。 細胞溶解およびクロマチン断片細胞ペレットを氷冷溶解緩衝液IL1 10mlの追加（100万個の細胞あたりの溶解緩衝液1mlを最適な比率である）。アップピペット上下に数回、穏やかに混合しながら4℃で10分間インキュベートする。 遠心機500×gで、4℃で5分間溶解液。上清を捨てる。 溶解液に氷冷溶解緩衝IL2の10ミリリットルを加え、ピペッティングにより穏やかに混合。 4℃で10分間、溶解物をインキュベートする。 500×gで4℃で5分間遠心し、上清を捨てる。 PrepaIS1剪断バッファ200倍プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を加える完全な剪断バッファ再。氷上で5分間のバッファを維持し、その後、氷上で動作する。ペレット各千万細胞に完全なIS1せん断緩衝液1mlを加え、穏やかにピペッティングにより混合します。超音波処理の前に、サンプルの粘度を低下させるために10分間氷上でサンプルをインキュベートする。 10サイクルの各々の2から3セットのための水浴超音波処理を使用して超音波処理によりクロマチン300μlのアリコートせん断。サイクルは30秒間 "ON"と高電力設定で30秒間 "OFF"から成る。代替的に、30秒 "ON"、30秒間 "OFF"の5〜10サイクルの短い超音波処理時間でピコ超音波処理装置を使用。簡単に言うと渦と実行の間のチューブをスピン。超音波処理器の他のタイプを使用する場合は、クロマチン断片化のために、製造者の指示に対応してください。 10分であり、C、16,000×gで断片化したクロマチンを遠心IPステップですぐに使用される上清をollect。また、将来の使用のために最大2ヶ月間-80℃でクロマチンを保存する。 事前の百分の1から1.5 TAEアガロースゲルまたはbionalyzerを用いた免疫沈降工程のクロマチン断片化の効率を分析します。最適なクロマチン断片サイズは、100〜600塩基対の範囲である。 2.低細胞チップ実験細胞収集及びDNA-タンパク質架橋 80パーセント-90％の合流点にしたHeLa-S3細胞を成長させる。培養培地を除去する1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで二回皿を洗い、そして培養プレートに1×トリプシン-EDTAを加える。皿から細胞を剥離するために2分の最大インキュベートする。 注：より長いインキュベーション時間は、細胞損傷につながる。 1ミリリットルの遠心チューブに血清を含む1mlの培地を添加して細胞を収集する。細胞を数える。 遠心分離機500×gで5分間、細胞。細胞数を持参固定のための培養培地1ml当たり10,000細胞である。 固定用の各チューブに36.5％の新鮮な準備されたホルムアルデヒドの27を添加する。チューブを2回または3回反転させ、室温で10分間インキュベートする。 チューブを反転、サンプルに2〜3回1.25 Mグリシン溶液の115μlを加え、室温で5分間インキュベートする。以降、この点から、氷上での作業。 4℃で10分間300×gで細胞を遠心します。ゆっくり上清を捨てる。 PIC（200X、最終濃度1×）で1ミリリットルの氷冷HBSSで細胞を洗浄。 4℃で10分間、300×gで細胞を遠心して再懸濁し、チューブを2回または3回反転する。優しく上清を捨て、氷の上で細胞ペレットを保つ。 細胞溶解およびクロマチン断片 10,000個の細胞あたりの完全な溶解バッファーTL1（溶解バッファーTL1 + PIC）の25μlのを追加し、細胞を再懸濁するために手動でチューブの底を攪拌する。氷上で5分間インキュベートします。 完全なHBSS（HBSS + PIC）の75μlの10,000個の細胞を含む各アリコートにバッファを追加します。 5サイクル各5セットのために超音波処理によって10,000個の細胞を100μlのアリコートせん断。サイクルは30秒間 "ON"と高電力設定で30秒間 "OFF"から成る。代替的に、30秒 "ON"、30秒間 "OFF"の5サイクルの短い超音波処理時間とともに使用ピコ超音波処理装置を使用。最適なクロマチン断片サイズは、100〜600塩基対の範囲である。クロマチン製剤、細胞型と異なる超音波処理器は、独立したせん断最適化実験が必要であることに注意してください。 遠心分離し、10分間14000×gで断片化したクロマチン不溶性物質を廃棄し、IPステップですぐに使用し、上清を収集する。また、将来の使用のために最大2ヶ月間-80℃でクロマチンを保存する。 百分の1から1.5 TAEアガロースゲルを用いて免疫沈降前工程のクロマチン断片化の効率を分析またはbionalyzer。剪断の視覚的評価を改善するために、前のアガロースゲル分析にRNアーゼを有する試料を扱う。最適なクロマチン断片サイズは、100〜600塩基対の範囲である。 3.クロマチン免疫沈降およびライブラリ準備標準的な自動ChIP実験のためにクロマチンをせん断し100μlにチップ·バッファH（チップ·バッファH + PIC）の120μlを添加する。 IPの200μlのを使用し、入力サンプルとして20μlまで2μLを保つ。 オートメーション機器で自動化されたチップ200μlのプロトコルを選択します。プロトコルのスループットは、実行ごとに1から16のサンプルです。 クロマチンは100万〜200万の細胞、抗H3K79me3の1-2μgのに対応し、使用して自動化ChIP実験を実行し、-H3K27me3、-H3K4me3、-H3K4me2、-H3K9ac、-H3K9 / 14ac、-H3K36me3とのH3K9me3のChIP-seqのグレードウサギポリクローナル抗体。最適な抗体量は、ヒストン修飾との親和性やスペックによって異なります対応する抗体のificity。 アイソタイプコントロール抗体として非免疫ウサギIgGの等量を使用してください。また、コーティングされていないビーズまたはチップコントロールなどの特定のブロックされた抗体を使用しています。各反応のためのタンパク質被覆磁気ビーズの20μlのを追加。 抗H3K79me3と-H3K4me2ポリクローナル抗体を用いて自動化されたChIP実験を行うために自動化されたヒストンチップ-seqのキット試薬​​を使用してください。 、抗H3K27me3でChIP実験を行うことが理想的なのChIP-seqのキット試薬​​を使用し-H3K4me3、-H3K9ac、-H3K9 / 14ac、-H3K36me3と-H3K9me3。 自動化装置内に実装されたソフトウェアの指示に従って自動化されたChIPプロトコルを選択します。抗体コーティング工程および免疫沈降ステップのための15時間4時間までのChIP実験パラメータを設定します。逆架橋工程を4時間65℃で自動化された機器で行われる。 自動化されたシステム上での逆架橋DNAを精製する。 AUTを選択磁気ビーズベースのDNA精製を使用して、プロトコルまたはキットでDNA精製のためのプロトコルをomated。水25μlのDNAを溶出。 免疫沈降したDNAの10％を抽出することにより免疫沈降したDNAを定量化する。免疫沈降したDNAの収量は、クロマチンと抗体、細胞型および標的ヒストン修飾の品質に依存する。製造業者の説明書に従ってアッセイキットを用いてDNAを定量化する。 少なくとも1陽性と1陰性対照ゲノム領域のためのプライマーを用いて定量的PCRによる免疫沈降したDNAの品質を分析します。のChIP濃縮度を評価するための総免疫沈降したDNAの10％以上を使用しないでください。 qPCR反応を準備します。 2X SyberGreen定量PCRマスターミックス10μlの、プライマーミックスを1μl、免疫沈降または入力DNAと20μlの最終反応容積に滅菌水アップの1-5を添加する。定量PCRプログラムは、95℃での初期変性ステップを含む5~10分間、Taqポリメラーゼのプロバイダによってアニール温度が選択されたプライマーに応じて設定されるべきである。 ChIPのDNAとしてだけでなく、同​​じクロマチン準備から保存された入力DNAの両方を使用してライブラリを構築するために、市販のイルミナのChIP-seqのライブラリ調製試薬と互換性のある自動化ライブラリプレッププロトコルを使用してください。ライブラリを調製するための各抗体から免疫沈降したDNAの10〜20 ngのを使用してください。ランあたり16自動ライブラリまで準備します。 ライブラリーの配列決定およびイルミナ製造元の指示に従ってクラスタを生成する。標準イルミナパイプライン、フィルター、主に次のようなバイオインフォマティクス解析（クラスターフィルタリング、ベースコーリングなど ） を実行し、エランドアライナで（現在のバージョンはGRCh38です）最新のヒトゲノムアセンブリに読み込む揃える。ピーク、呼び出しのためにSICER 7またはMACS 8を使用して、ワットピークの下流の分析を実行i番目ホーマー9、BEDTools 10又は好ましいソフトウェア。 自動化された低細胞数のChIP実験のためにクロマチンをせん断し100μlに完全なチップバッファtC1の（チップ·バッファtC1の+ PIC）の120μlを添加する。 IPの200μlのを使用し、入力として20μLを保つ。 自動化システムで自動化されたチップ200μlのプロトコルを選択します。プロトコルのスループットは、実行ごとに1から16のサンプルです。 低クロマチン量で動作するように最適化された自動化されたChIPの試薬とチップグレード抗体を使用して自動化のChIP-seqの実験を実行します。 10,000個の細胞および100,000個の細胞、抗H3K27me30.5μgの、0.25μgの-H3K4me3、0.1μgの-H3K27ac、0.25μgの-H3K9me3ウサギプレミアムチップ-seqのグレードウサギポリクローナル抗体に対応したクロマチンを使用してください。最適な抗体量は、ヒストン修飾と対応する抗体の親和性および特異性に応じて異なる。 非免疫RAB等量のに使用しますアイソタイプコントロール抗体として、ビットのIgG。また、コーティングされていないビーズまたはチップコントロールなどの特定のブロックされた抗体を使用しています。各反応のためのタンパク質被覆磁気ビーズを10μlを追加。 自動化装置内に実装されたソフトウェアの指示に従って自動化されたChIPプロトコルを選択します。抗体コーティング工程および免疫沈降ステップのための15時間4時間までのChIP実験パラメータを設定します。逆架橋工程を4時間65℃で自動化された機器で行われる。 製造者の指示に従ってスピンカラムを用いて逆架橋されたDNAを精製し、水25μlに6μLからボリュームに溶出する。 市販のアッセイキットを用いてDNAを定量化する。 ChIPの品質を評価するために正と負の制御領域のためのプライマーを用いたqPCRにより結果を分析する。 低DNAの泉とのライブラリーを調製するために最適化されたライブラリ調製試薬でライブラリ調製キットを使用して、tities。ライブラリを調製するための30のPGとチップDNAの300 PG（それぞれ10,000 100,000細胞実験に相当）を使用します。ライブラリ調製試薬と互換性のある自動化されたプロトコルを使用してライブラリを準備します。自動ライブラリの準備のスループットは、実行ごとに1から48までのライブラリです。 二本鎖DNA鋳型の末端修理の後、配列決定プライマー部位を含む切断可能なステムループアダプタをライゲート。 DNA伸長工程の後に、ライブラリ調製キットのプロトコールに記載された高忠実度の増幅法でサンプルを増幅する。 図書館増幅後、ライブラリ調製キットのガイドライン以下のライブラリを定量化し、浄化する。精製は必要ありませんした後にそのサイズの選択に注意してください。 ライブラリーを配列し、製造業者の指示に従ってクラスタを生成する。スタンド以下の主要なバイオインフォマティクス解析（クラスターフィルタリング、ベースコーリング、 など ） を実行ARDメーカーパイプライン、フィルタ、および揃えるエランド7アライナで（現在のバージョンはGRCh38です）最新のヒトゲノムアセンブリに読み込みます。 、BEDTools 10、または任意の好ましいソフトウェアをピーク通話用SICER 8またはMACS 9を使用し、ホーマーとピークの下流の分析を行う。 IP-スターコンパクトで自動化されたChIP実験をセットアップする方法を示すソフトウェアの図1.スクリーンショット。ソフトウェアが動作あたりのサンプル量を選択するだけでなく、重要な実験パラメータ（抗体コーティング、IPおよび洗浄を変更する柔軟性を提供）研究者のニーズに応じた。自動化された手順を並列に異なる条件（ すなわち 、異なる種類および抗体の量、異なる種類の細胞の量、さらには異なるTをテストすることができますYPESと同じ実行中の磁気ビーズの量。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 自動化システム内のライブラリキットを使用して、次世代シーケンシングのための自動化されたライブラリの準備をセットアップする方法を示すソフトウェアの図2のスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。