Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

1. Expériences standard ChIP collection cellulaire et les protéines et l'ADN réticulation. Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter la trypsine-EDTA (1x) à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte. Recueillir les cellules et laver deux fois avec 10 ml de PBS. NOTE: Plus long temps d'incubation vont conduire à des dommages cellulaires. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g et remise en suspension des cellules dans 20 ml de PBS. Passez à compter les cellules. Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 500 xg, jeter le surnageant et ajouter 500 ul de PBS. Le nombre optimal de cellules pendant l'étape de fixation est de 10 millions de cellules par 500 pi de PBS. Ajouter 13,5 ul de 37% de formaldéhyde fraîche dans chaque fraction aliquote de 500 pl de suspension cellulaire. Fixer les cellules pendant 8 minutes à température ambiante. Ajouter 57 ul de 1,25 M de glycine solution pour arrêter la fixation. Incuber pendant 5 min à température ambiante avec agitation constante par vortex doux. Travailler sur la glace partir de ce point. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant sans déranger le culot cellulaire. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace. La lyse des cellules et la chromatine cisaillement Ajouter 10 ml de glace iL1 tampons de lyse froid au culot de cellules (1 ml de tampon de lyse par million de cellules est le rapport optimal). Pipette de haut en bas plusieurs fois et incuber pendant 10 min à 4 ° C en mélangeant doucement. Centrifuger le lysat pendant 5 min à 500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant. Ajouter 10 ml de tampon de lyse froid glace iL2 aux lysats et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber les lysats pendant 10 min à 4 ° C. Centrifuger pendant 5 min à 500 g et 4 ° C et jeter le surnageant. Prepare le tampon de cisaillement complet adjonction, 200x cocktail d'inhibiteurs de protease (PIC) de la mémoire tampon de cisaillement iS1. Gardez le tampon sur la glace pendant 5 min et de travailler sur la glace par la suite. Ajouter 1 ml de la mémoire tampon complète de cisaillement iS1 à chaque 10 millions de cellules Pellet et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas. Avant la sonification Incuber les échantillons sur de la glace pendant 10 min pour réduire la viscosité de l'échantillon. Cisaillement 300 ul de parties aliquotes de la chromatine par sonication en utilisant un sonicateur de bain d'eau pendant 2 à 3 séries de 10 cycles chacun. Un cycle se compose de 30 sec "ON" et 30 sec "OFF" sur un réglage de puissance élevée. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication avec un temps de sonication plus courte de 5 à 10 cycles de 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Brièvement vortex et tourner les tubes entre les pistes. Lors de l'utilisation d'autres types de sonicateurs, suivez les instructions du fabricant correspondant pour la chromatine cisaillement. Centrifuger la chromatine cisaillé à 16 000 xg pendant 10 min et collect le surnageant à être utilisé immédiatement dans l'étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois pour une utilisation future. Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l'étape d'immunoprécipitation utilisant 1-1,5% de gels d'agarose TAE ou bionalyzer. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. 2. Faible expériences cellulaire ChIP collection cellulaire et les protéines et l'ADN reticulation Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter 1x trypsine-EDTA à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte. NOTE: Plus long temps d'incubation vont conduire à des dommages cellulaires. Recueillir les cellules par addition de milieu de culture de 1 ml contenant du sérum dans un tube de centrifugation de 1 ml. Compter les cellules. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Porter le nombre de cellulesà 10 000 cellules par ml de milieu de culture pour la fixation. Ajouter 27 pi de 36,5% de formaldéhyde préparés frais dans chaque tube pour la fixation. Inverser le tube deux ou trois fois et incuber 10 min à température ambiante. Ajouter 115 ul de 1,25 M de glycine à la solution de l'échantillon, le tube inverser deux ou trois fois et incuber 5 minutes à température ambiante. Travailler sur la glace partir de ce point. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant lentement. Laver les cellules avec 1 ml de glace froide HBSS avec PIC (200x, concentration finale 1x). Inverser le tube deux ou trois fois pour remettre en suspension les cellules et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace. La lyse des cellules et la chromatine cisaillement Ajouter 25 ul de tampon de lyse complet tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) par 10 000 cellules et agiter manuellement le fond du tube pour remettre en suspension les cellules. Incuber sur de la glace pendant 5 min. Ajouter 75 pi de HBSS complet (HBSS + PIC) tampon dans chaque aliquote contenant 10 000 cellules. Cisaillement aliquotes de 100 pi de 10 000 cellules par ultrasons pendant 5 séries de 5 chaque cycle. Un cycle se compose de 30 sec "ON" et 30 sec "OFF" sur le réglage haute puissance. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication utilisé avec un temps de sonication plus courte de cinq cycles de 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. Notez que les préparations de chromatine, des types de cellules différents et nécessitent d'ultrasons expériences d'optimisation de cisaillement distincts. Centrifugeuse la chromatine cisaillé à 14 000 g pendant 10 min à jeter l'insoluble et recueillir le surnageant à être utilisé immédiatement dans l'étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu'à deux mois pour une utilisation future. Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l'étape d'immunoprécipitation utilisant 1-1,5% TAE gels d'agarose oul'bionalyzer. Traiter les échantillons avec de la RNase avant l'analyse sur gel d'agarose afin d'améliorer l'évaluation visuelle de cisaillement. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. 3. Immunoprécipitation de la chromatine et de la Bibliothèque Prep Pour standards automatisé expériences ChIP Ajouter 120 ul de la puce tampon H (Chip tampon H + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l'IP et de garder 2 pi à 20 pi comme échantillon d'entrée. Sélectionnez le automatisé ChIP 200 protocole ul dans l'instrument d'automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle. Exécutez une expérience de ChIP automatisé utilisant, chromatine correspondant à 1-2000000 cellules, 1-2 ug d'anti-H3K79me3, le grade -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et H3K9me3 ChIP-seq des anticorps polyclonaux de lapin. Montants anticorps optimales varient selon la modification des histones et l'affinité et la specificity de l'anticorps correspondant. Utiliser des quantités égales de non-IgG de lapin immunisé comme un anticorps de contrôle d'isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 20 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction. Utilisez les histones automatisé ChIP-seq kit de réactifs pour effectuer des expériences de ChIP automatisés avec des anti-H3K79me3 et polyclonaux -H3K4me2. Utilisez le kit de réactifs de ChIP-seq idéales pour effectuer des expériences de puce anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3. Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l'appareil d'automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l'étape de revêtement d'anticorps et 15 heures pour l'étape d'immunoprécipitation. L'étape de réticulation inverse a lieu dans l'instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures. Purifier l'ADN réticulé inverse sur le système automatisé. Sélectionnez automated protocoles pour la purification d'ADN avec un protocole ou un kit utilisant magnétique purification d'ADN à base de perles. Éluer l'ADN dans 25 pi d'eau. Quantification de l'ADN immunoprécipité par extraction de 10% de l'ADN immunoprécipité. Le rendement en ADN immunoprécipité dépend de la qualité de la chromatine et l'anticorps, le type de cellule cible et la modification d'histone. Quantification de l'ADN en utilisant un kit de dosage selon les instructions du fabricant. Analyser la qualité de l'ADN immunoprécipité par PCR quantitative en utilisant des amorces pendant au moins une positive et une régions génomiques de contrôle négatif. Ne pas utiliser plus de 10% de l'ADN immunoprécipité total pour évaluer enrichissements puce. Préparer les réactions de qPCR. Ajouter 10 ul d'un mélange maître 2x Sybergreen qPCR, 1 ul de mélange d'amorces, 1-5 ul d'ADN immunoprécipité ou de l'entrée et de l'eau stérile jusqu'à 20 ul de volume réactionnel final. Le programme PCR quantitative comprend une étape de dénaturation initiale à 95 ° Cpendant 5-10 min selon le fournisseur de la Taq polymérase et les températures de recuit doivent être définies en fonction des amorces choisies. les protocoles de préparation de bibliothèque automatisé Utilisation compatibles avec les Illumina ChIP-seq réactifs de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce pour construire des bibliothèques utilisant à la fois l'ADN de ChIP ainsi que l'ADN d'entrée enregistré à partir de la même préparation de la chromatine. Utilisez 10-20 ng d'ADN immunoprécipité de chaque anticorps pour la préparation bibliothèque. Préparer jusqu'à 16 bibliothèques automatisées par cycle. Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant Illumina. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) conformément à la norme Illumina pipeline, filtre et alignez le lit à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec l'alignement ELAND. Utilisez SICER 7 ou 8 MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics wième Homer 9, 10 ou logiciels bedtools préféré. Pour nombre automatisé à faible cellulaires expériences ChIP Ajouter 120 pi de tampon de ChIP complète tC1 (Chip Buffer tC1 + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l'IP et de garder 20 pi comme entrée. Sélectionnez automatisé ChIP 200 protocole ul dans le système d'automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle. Exécutez une expérience de ChIP-seq automatisé utilisant des réactifs de ChIP automatisés et des anticorps de qualité ChIP optimisés pour travailler sur des quantités faibles de la chromatine. Utilisation chromatine correspondant à 10 000 cellules 100 000 cellules, et 0,5 pg d'anticorps anti-H3K27me3, 0,25 ug -H3K4me3, 0,1 ug -H3K27ac, 0,25 ug -H3K9me3 anticorps polyclonaux de lapin lapin professionnelles ChIP-seq qualité. Montants anticorps optimales varient en fonction de la modification des histones et l'affinité et la spécificité de l'anticorps correspondant. Utilisez quantité égale de rab non-immuneIgG de bits comme un anticorps de contrôle d'isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 10 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction. Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l'appareil d'automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l'étape de revêtement d'anticorps et 15 heures pour l'étape d'immunoprécipitation. L'étape de réticulation inverse a lieu dans l'instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures. Purifier l'ADN réticulé inverse en utilisant des colonnes de centrifugation suivant les instructions du fabricant et éluer des volumes de 6 pi à 25 pi d'eau. Quantification de l'ADN en utilisant un kit de dosage commercial. Analyser les résultats de qPCR en utilisant des amorces pour les régions de témoins positifs et négatifs pour évaluer la qualité de la puce. Utilisez un kit de préparation bibliothèque avec des réactifs de préparation de bibliothèques optimisé pour préparer des banques à faible quan d'ADNtités. Utilisez 30 pg et 300 pg de puce à ADN (correspondant à 10 000 et 100 000 cellules expériences respectivement) pour la préparation bibliothèque. Préparer bibliothèques utilisant le protocole automatisé compatible avec les réactifs de préparation bibliothèque. La bibliothèque prep débit automatisé est de 1 à 48 bibliothèques par cycle. Après la réparation des modèles d'ADN double brin extrémité, ligaturer les adaptateurs clivables tige-boucle contenant les sites d'amorce de séquençage. Après l'étape d'extension de l'ADN, amplification de l'échantillon avec la méthode d'amplification décrite haute fidélité dans la bibliothèque protocole de kit de préparation. Après amplification bibliothèque, de quantifier et de purifier les bibliothèques suivantes la bibliothèque directives du kit de préparation. On notera que la sélection de la taille, après purification ne est pas nécessaire. Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) à la suite du standpipeline de fabricant ard, filtre, et aligner les lectures à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec le ELAND 7 alignement. Utilisez SICER 8 ou 9 MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics avec Homer, bedtools 10, ou ne importe quel logiciel préféré. Figure 1. Captures d'écran du logiciel montrant comment mettre en place des expériences de ChIP automatisées sur le IP Compact-Star. Le logiciel offre la possibilité de choisir la quantité d'échantillons par cycle ainsi que pour modifier les paramètres expérimentaux clés (Anticorps revêtement, IP et lavages ) en fonction des besoins du chercheur. La procédure automatisée permet de tester différentes conditions en parallèle (par exemple, différents types et quantités d'anticorps, différents types et quantités de cellules et même différente types et quantités de billes magnétiques dans la même série. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Captures d'écran du logiciel montrant comment mettre en place la préparation de la bibliothèque automatisée pour le séquençage de prochaine génération en utilisant le kit de la bibliothèque dans le système d'automatisation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.