Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando tamponi prodotti commercialmente, gel e trasferimento pile al fine di ridurre la variabilità e migliorare la coerenza. Fare riferimento alla Lista Materiali per un elenco completo dei materiali di consumo necessari. Fluorescente protocollo WB con I-Blot trasferimento veloce e sistema di imaging Odyssey LI-COR 1. Preparazione del campione Selezione Buffer / preparato Selezionare un tampone di estrazione adeguato per il campione omogeneizzazione e assicurarsi che il buffer è compatibile con tutte le tecniche a valle che possono essere impiegati. Preparare un tampone di estrazione: tampone RIPA (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% desossicolato di sodio, 0,1% SDS) contenente 5% cocktail inibitore di proteasi prima campionare isolamento. NOTA: Ci sono molti tipi differenti di buffer di estrazione disponibili e sono selezionati in base alla sede della proteina di interesse all'interno della cellula. Questi includono ma non sonolimitato al buffer RIPA (cellula intera, mitocondriale e componenti nucleari), NP-40 buffer di lisi (a cellule intere o legato alla membrana) e Tris-Triton (citoplasmatica scheletrico legato). Tuttavia, alcuni detergenti chimici all'interno di buffer di estrazione possono aiutare a solubilizzare o anche disattivare una proteina, ma possono interferire con la determinazione delle proteine ​​quando si utilizza uno specifico test determinazione delle proteine, ad esempio, l'acido bicinconinico (BCA) test. Controllare linee guida del produttore per quanto riguarda la compatibilità chimica con il test. Estrazione di proteine ​​/ solubilizzazione Macerare manualmente il campione di tessuto con le forbici e / o bisturi seguito da omogeneizzazione utilizzando sia un Dounce o un omogeneizzatore elettrico portatile con una punta di polipropilene nel tampone di estrazione preparato a circa 1:10 w / v (peso del tessuto / polmone) fino un / omogeneizzato coerente liscia è prodotto. NOTA: Per i più piccoli, preziosi / difficile da ottenere campioni, estrazioni detergenti a base can essere ancora efficace fino a 1: 5. Posta omogeneizzazione, campioni centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante contenente le proteine ​​solubilizzati e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Conservare pellet insolubili per consentire l'estrazione ulteriormente più severe, se necessario in seguito. Procedere alla determinazione delle proteine ​​passo 1.3. Determinazione delle proteine Determinare la concentrazione di proteine ​​all'interno di ciascun campione estratto usando o una BCA, Bradford o dosaggio simile. Per il calcolo della curva standard, garantire che il coefficiente di rapporto di determinazione, valore R al quadrato, è maggiore o uguale a 0,99, che riflette la determinazione più accurata di proteine ​​abbondanza nei campioni 15. NOTA: Tutti i campioni messi a confronto da QFWB deve essere analizzato contro la stessa curva standard. Preparazione del campione Pianificare e registrare l'ordine di caricamento di scale e campioni per 2 identici gels: Gel 1 per il trasferimento e gel 2 come controllo di caricamento. Caricare il controllo e campioni "trattati" in modo sequenziale al fine di evitare qualsiasi pregiudizio che potrebbe derivare con il trasferimento di scarsa o inequivocabile. Calcolare il volume proteina necessaria per ciascun campione. Un carico di proteine ​​standard per rilevare le proteine ​​in isolati neuronali è di 15 mg. Rendere ogni campione fino a un volume di 10 ml con dH 2 O. Aggiungere 5 ml di tampone di caricamento, vortex e scaldare a 98 ° C per 2 min. Includere un campione di controllo positivo come una proteina ricombinante per aiutare con l'identificazione del corretto banda di interesse. Tuttavia preparare il campione di controllo positivo correttamente seguendo le linee guida del produttore per evitare la selezione delle bande sbagliate. Vedere la Figura 1. Figura 1. PSelezione controllo ositive. L'aggiunta di controlli positivi per un esperimento conferma l'etichettatura rilevata è reale. Tuttavia, la cautela deve essere presa al fine di garantire il vostro controllo funzioni correttamente prima di utilizzare campioni sperimentali. A) proteina di fusione TREM 2 è stato caricato a linee guida di 1 mg / ml del produttore, tuttavia l'etichettatura osservata a 110 conflitti kDa con questa scheda predetto molecolare peso di 60-70 kDa. B) Dopo l'aggiunta e l'incubazione con l'agente riducente, l'etichettatura proteina di fusione è stato rilevato il peso molecolare previsto. Tuttavia, questo significa un maggiore carico proteina era necessaria come il processo di riduzione diminuito il segnale della proteina. 2. Separazione elettroforetica delle proteine Preparazione del 4-12% gel Bis / tris (1,0 mm) NOTA: gel gradiente vengono utilizzati per la produzione di una maggiore separazione delle proteine ​​in un ampio intervallo di peso molecolare. Selezionare e preparare MESo MOPS tampone di corsa (1 L per vasca) diluendo con dH 2 O. Tampone MES produce una migliore risoluzione delle proteine ​​all'interno di 3,5-160 kDa mentre POM tampone di corsa è preferibile per rilevare maggiori proteine ​​di peso molecolare superiore a 200 kDa tuttavia avrà risoluzione più povera di proteine ​​più basso peso molecolare inferiore a 15 kDa. Rimuovere il pettine e la striscia di nastro che copre il piede del gel. Lavare delicatamente i pozzetti con tampone di corsa con una pipetta 1 ml. Riempire i pozzetti con tampone di corsa e garantire che non rimangano bolle nel gel. Preparazione Gel e carico Inserire i gel nel serbatoio e riempire il vano tra gel con tampone di corsa al fine di garantire tutte le guarnizioni funzionino in modo efficace. Aggiungere 3 ml di standard di peso molecolare nel primo pozzo in gel 1 e 2. Caricare il gel 10 ml di ciascun campione nei pozzetti successivi. NOTA: Con l'eccezione delle scale, gel 1 e 2 gel devono essere identiche. E 'imperativo °al pre-tinto standard di peso molecolare utilizzati per il gel 2 è blu e visibile quando si utilizza una macchia di proteine ​​totali in modo da essere visibile nel canale di Odissea imager 700. Una volta che entrambi i gel sono caricati, riempire il serbatoio con il restante tampone di corsa e fissare il coperchio. Elettroforesi "Run" gel a 80 V per 4 minuti per garantire il campione entra nella matrice di gel di poliacrilammide in modo uniforme. Successivamente aumentare la tensione e tempo di 180 V per 50 minuti, rispettivamente, o fino a quando il colorante campione può essere visto ai piedi del gel. NOTA: Higher tensioni possono essere applicate per ottenere tempi di esecuzione più brevi. Tuttavia, questo può portare a gel "smiley", dove i campioni medi dei gel corrono più velocemente dei campioni corsie esterne causate da un aumento della temperatura 14. 3. Totale Stain Proteina del Gel Loading controllo Gel Release 2 dalla cassetta conun coltello gel. Rimuovere i pozzetti e il piede del gel. Segnare il gel per facilitare l'orientamento. Decantare circa 30 ml della macchia proteine ​​in una capsula di Petri quadrato (dimensioni approssimative 12 x 12 cm). Porre il gel 2 nella macchia proteine, garantendo la soluzione copre l'intero gel, poi agitare il gel per almeno 1 ora a temperatura ambiente per colorare. Decantare la macchia di proteine ​​e lavare i 3x gel in acqua distillata prima della visualizzazione. Passare al punto 6.3 per visualizzare. 4. I-Blot Semi Dry proteina di trasferimento veloce NOTA: tutti i reagenti necessari per il trasferimento delle proteine ​​utilizzando la macchina I-Blot sono prodotti commerciali specificamente progettati per la metodologia I-Blot e può essere trovato nella lista dei materiali. Preparare il "fondo" stack trasferimento. Togliere il coperchio stagnola e pre-bagnato con tampone di corsa direttamente dal serbatoio di gel. Carta da filtro di prelavaggio con acqua distillata. Ripetere il punto 3.1 e il luogo gel 1 suil "fondo" stack trasferimento preparato. Stendere la carta da filtro pre-umido, su tutto il gel. Stendere la carta da filtro e gel per garantire l'assenza di bolle intrappolate tra gli strati. Rimuovere il coperchio foglio dalla pila di trasferimento superiore e fissare la pila superiore sulla parte superiore della carta da filtro e pila inferiore. Arrotolare la pila di trasferimento "sandwich" per eliminare eventuali bolle d'aria. Inserire la spugna dal kit pila trasferimento sul coperchio della macchina I-Blot. Posizionare il panino pila trasferimento sullo spazio dedicato sulla macchina I-Blot quindi chiudere il coperchio in modo sicuro. Avviare l'I-Blot e trasferire per 8.5 minuti a programma 3. Se c'è un segnale basso di proteine ​​o irregolari alti: bassi tassi di peso molecolare della proteina, verificare i tempi di trasferimento del produttore quando si utilizza un metodo semi secco "veloce" di trasferimento. Eseguire un semplice protocollo di ottimizzazione usando ripetizioni di campionamento di carico identica per determinare la combinazione ideale di tensione / tempo di trasferimento come si vede in figura 2 . Figura 2. Ottimizzazione del trasferimento usando l'I-Blot. A) Un unico gel caricato con scaletta e 15 microgrammi di murine tutta omogenato cerebrale in tre ripetizioni in tandem è stato tagliato in tre sezioni. Una sezione non è stato trasferito, uno è stato trasferito per 7.5 min (come da linee guida del produttore) e uno per 8.5 min. Le sezioni di gel sono state poi colorate con immediata macchia proteina blu, scansione su un Termovisore nel canale 680 e quantificati. B) Rappresentazione grafica dei valori di quantificazione che dimostrano la differenza nel contenuto proteico residua di ciascun gel dopo 0, 7,5, e 8,5 min di trasferimento. Si noti che un ulteriore minuto di tempo di trasferimento ha comportato ulteriore trasferimento di proteine ​​di circa 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 5. anticorpo di rilevazione delle proteine Preparazione membrana e il blocco Rimuovere pila trasferimento dalla macchina I-Blot. Rimuovere lo strato superiore e la carta da filtro esponendo il gel sulla pila di trasferimento inferiore. Tagliare intorno gel con un bisturi e garantire che un taglio triangolare per orientarsi è rappresentato sulla membrana. A seguito di membrana taglio, proteine ​​macchia il gel per verificare l'efficienza di trasferimento e / o scartare. Spostare rapidamente la membrana in un ambiente pulito tubo da 50 ml (o presa equivalente) contenente 5 ml di PBS 1x e posto su un rullo meccanico (o piattaforma orbitale) per la costante agitazione. NOTA: E 'fondamentale che la membrana non è consentito ad asciugare. Durante il trasferimento semi-secco la membrana si surriscalda. Attendere 2 minuti prima di aprire la risma di trasferimento in modo da poter it raffreddare e tempo di asciugatura lento durante pila decostruzione. L'uso di un rullo e tubo per l'agitazione durante i lavaggi e incubazione consente significativa riduzione dei volumi di soluzioni richieste. Lavare la membrana 3 x 5 min in PBS 1x. Eliminare il PBS 1x e bloccare la membrana con tampone di bloccaggio non diluito per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Preparazione anticorpo primario. Preparare l'anticorpo primario in base alle linee guida del produttore in 5 ml di tampone di bloccaggio con il 0,1% Tween20. Incubare la membrana con l'anticorpo primario preparata notte a 4 ° C con agitazione costante. NOTA: Tampone di arresto è generalmente usato non diluito, ma può essere diluito fino a 1: 4 con PBS se l'anticorpo primario ha abbastanza alta specificità. Eliminare l'anticorpo primario e lavare la membrana 6 volte per 5 minuti ciascuno con PBS 1x. Selezione e preparazione secondaria di anticorpi Per secondary solo l'etichettatura di valutazione a fini di controllo, omettere passi 5.2.1 e 5.2.2 di cui sopra e procedere al punto 5.3 per determinare campioni specifici modelli di bande secondarie. Vedere la Figura 3. Figura 3. Ottimizzazione di anticorpi secondari. A) Un confronto a più specie di secondaria soltanto un'etichettatura non specifica contro 15 mg di murina (M), ovini (O) ed equini (E) omogenati di tessuto nervoso con una varietà di fluorescenza tagged anticorpi secondari . L è la scala peso molecolare. Tessuto omogenato di pecora è stato l'unico campione cross-reagiscono con l'etichettatura secondario quando si utilizza asino anti-capra 800 anticorpi. B) E 'anche importante accertare se l'etichettatura non specifico si verifica quando si utilizza un campione di tessuto diverso, vale a dire, muscolo gastrocnemio murino (15 _6; carico g). Questa croce campione reagisce con l'anticorpo secondario asino anti-topo 680, ma questo non si è verificato quando si utilizza omogenato di cervello di topo. Preparare la fluorescenza tagged anticorpo secondario 680 o 800 (rosso o canale verde) seguente costruttore concentrazioni raccomandato in tampone di bloccaggio con il 0,1% Tween20. Incubare la membrana al buio con l'anticorpo secondario preparata per 90 min a temperatura ambiente con agitazione costante. Eliminare l'anticorpo secondario e lavare la membrana 6 volte per 5 minuti a lavaggio con PBS 1x. Passare al punto 6 – visualizzazione. Se la visualizzazione dei marcatori non funziona come previsto, scale d'esame con una serie di anticorpi secondari come un ulteriore passo adeguato. Non tutti gli anticorpi secondari permettono la visualizzazione di tutte le bande marcatori in tutte le scale disponibili in commercio. Se le bande attese non sono visibili, utilizzare un host secondario alternativa, vale a dire, donkey anti- coniglio contro di capra anti coniglio rappresenta una modifica protocollo adatto. Vedere la Figura 4. Specie host utilizzato per sollevare un anticorpo secondario possono a volte causare un problema con visualizzazione a causa della mancanza di specificità per gli anticorpi primari specifici. Figura 4. Risoluzione dei problemi specificità anticorpo secondario Western Blot di una serie di campioni di tessuto (15 mg di proteine ​​per corsia) -. Grasso, muscolo, fegato e ossa – incubate con anticorpo primario ERK e incubate con anticorpi secondari tre differenti. Pannello superiore: WB marcato con LI-COR di capra anti-coniglio 680 anticorpo secondario prodotto etichettatura debole di grasso e ossa e nessun segnale è stato rilevato nei campioni di fegato e muscolo. Pannello centrale: a membrana (dal pannello in alto) è stato spogliato e reprObed utilizzando la metodologia ECL e di capra anti-coniglio HRP legata secondario. Bands sono ora visibili in campioni di muscolo e del fegato e l'etichettatura appare più intenso nei campioni di grasso e ossa. Pannello inferiore: a membrana (dal pannello superiore e medio) è stato messo a nudo e reprobed con LI-COR Donkey anti-coniglio 680 anticorpo secondario che ha mostrato una maggiore affinità per l'anticorpo primario ERK. Etichettatura per i muscoli e il fegato è ora visibile con una maggiore intensità del segnale da campioni sia di grasso e delle ossa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 6. Visualizzazione NOTA: Tutte le immagini sono acquisite con l'imager LI-COR Odyssey Classic e Immagine associata software di analisi Pro (versione 3.1.4). Accendere e accedere al computer e imager. Aprire il software di imaging e creare un nuovo file. Vedere la Figura 5. <p class="Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 5. Visualizzazione e quantificazione di western blot. Eseguire la scansione di una macchia occidentale che mostra murino muscolo gastrocnemio (30 mg carico) sondato con annessina V anticorpo primario (36 kDa) e di capra anti-coniglio 800 anticorpo secondario. La membrana è stata digitalizzata e visualizzato nel canale 800. Per quantificare la proteina (annessina V), una scatola rettangolare viene disegnata attorno alla banda di interesse da esempio 1. Questo viene poi copiato e incollato sulle restanti piste del campione per assicurare una misurazione della stessa area. Sfondo è contabilizzato automaticamente in base alla forma disegnata, ma questo può essere modificato per garantire la misurazione del fondo è definito con precisione. La tabella seguente mostra le misure quantificate di ogni forma disegnata incluso il segnale totale ottenuto, di fondo e di segnale con sfondo sottratto. Queste informazioni possono poi essere esportati in unfoglio di calcolo per calcolare i rapporti di espressione (come determinato da intensità di fluorescenza relativa) e consente successive analisi statistiche da eseguire. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Aprire il coperchio della termocamera. Versare una piccola quantità di PBS 1x sul vetro nell'angolo inferiore sinistro e poi posizionare la membrana sopra il PBS. Assicurarsi che la membrana è quadrata con l'asse sulla termocamera e spazio di 1 CM è lasciato tra la membrana e l'asse della griglia. Rotoli membrana per garantire che non siano presenti bolle tra il vetro e la membrana. Contare il numero di quadrati membrana occupa sulla xe asse y. Chiudere il coperchio della termocamera. Inserire il numero di quadrati membrana occupa sul software del computer. Selezionare il canale appropriato per la scansione della membrana che dipenderà tag fluorescentidell'anticorpo secondario, cioè 700 canali o 800 canale quando un anticorpo fluorescente con tag 680 o 800 è stato usato rispettivamente. Quando doppia etichettatura viene effettuata, la scansione in entrambi i canali. NOTA: Ottimizzare l'etichettatura singola proteina prima di effettuare doppia etichettatura. Selezionare l'intensità per scansionare la membrana, se una proteina di alta abbondanza utilizza una scansione a bassa intensità. In alternativa, se l'anticorpo primario ha scarsa affinità per la proteina di interesse per selezionare una scansione maggiore intensità, cioè il livello 5. Premere start per avviare la scansione. Passare al punto 6.4. Visualizzazione del gel di controllo di carico (Figura 6). Figura 6. etichettatura delle proteine ​​totali e l'analisi. A) Fotografia di un totale di proteine ​​in gel con etichetta contenente 20 mg di equina cervicale gangli omogenato per corsia. B) Gel da Pannello Aacquisita per ottenere il 680 canali. C) Grafico delle misurazioni quantificati dalla proteina gel colorato totale ottenuto mediante software di imaging. Una serie di misure determinato da marcatori di peso molecolare, cioè, 30-110 kDa, sono prese a fornire un istogramma delle misure al fine di garantire standard error (SEM) è bassa (dei campioni raggruppati) che indica che i livelli di proteine ​​totali in ogni campione sono uniformi attraverso il gel. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Seguire i punti 6.1 e 6.2. Versare l'acqua distillata sul vetro nell'angolo in basso della termocamera dove inizia l'asse della griglia. Porre il gel sulla superficie dell'acqua e manovrare così le corsie sono perpendicolari x o asse y della griglia. Lasciare uno spazio di 1 cm tra il sull'asse y ed x della griglia e il gel e contare il numero di quadrati gel occupa sull'asse griglia. Vicinoil coperchio della termocamera. Inserire il numero di quadrati del gel occupa sul software del computer. Selezionare il canale 700 per eseguire la scansione della proteina macchiato gel totale. NOTA: blu fluorescente nel canale 700. Impostare l'intensità di 5 e premere start. Quantificazione immagine acquisita di Regolare i tasti di luminosità e contrasto per produrre la migliore qualità di immagine. Se vi sembra di essere alto rumore di fondo, ripetere la scansione della membrana con un'intensità inferiore e utilizzare l'impostazione di scansione di alta qualità. NOTA: Le eventuali rettifiche non alterano i dati a fluorescenza acquisiti durante la scansione. Ruotare immagini di 90 °, 180 ° e 270 ° in modo da visualizzare nell'orientamento desiderato senza alcuna modifica dei dati acquisiti. Tuttavia, quando si effettuano piccoli aggiustamenti di orientamento in "rotazione libera", di superiore al 3 °, i dati acquisiti in valori pixilation può diventare distorta e quindi influenzare i risultati di quantificazione. Selezionare una forma dal menu a forme – utilizzare un rettangolo, nella maggior parte dei casi – e disegnare attorno alla banda di interesse (WB) o l'intera corsia (gel di proteine ​​totali) nel campione di corsia 1. Copia e incolla la forma attraverso il campione corsia 2 banda di interesse o di tutta la corsia. Ripetere su ogni singola banda di interesse per ogni campione e per ogni corsia per un totale di gel di proteine. Verificare che la misurazione del fondo non incorpora un segnale nella corsia. Lo sfondo può essere detratto automaticamente dal software e racchiudono tutto il bordo attorno alla forma disegnata oppure può essere specificato per essere superiore / inferiore o sinistro e destro della forma. In alternativa, indicare una casella di sfondo definito dall'utente. Visualizzare il segnale per la tabella forme per ciascuna forma disegnata in unità arbitrarie fluorescenti. Lo sfondo sarà automaticamente detratto dal segnale. Esportare l'immagine come file TIF per visualizzare in diversi software. Non esportare l'immagine e manipolare USIng non immagine software professionale in quanto ciò altera i dati originali acquisiti dal imager generazione di dati falsi. Ripetere i punti 6.4.3-6.4.7 nella quantificazione doppia etichettatura o di effettuare misurazioni multiple su gel di controllo di carico per generare e raccogliere dati di errore standard. 7. Messaggio visualizzazione Tenere le membrane in 1x PBS o asciugare per la conservazione a lungo termine delle future rivalutazioni, sondare e stripping di membrane per altre proteine ​​di interesse. Spogliarello e ri-probing delle membrane. Vedere la Figura 7. Figura 7. Membrana stripping e reprobing. Esempi rappresentativi di membrane seguito varie fasi di stripping scansionati con un sistema di imaging a raggi infrarossi. A. La prima immunolocalizzazione stata effettuata con CSP anticorpo primario (coniglio) e letto all'uscita 700 canali. B. Prima stripping e reprobing con ROCK2 (coniglio) con 800 canali. Freccia arancione indica restante CSP anticorpo primario presente dopo la striscia e ri-sonda. Questo non influenza la misura della ROCK2 come banda è presente a un peso molecolare più elevato (freccia bianca). C. Secondo stripping e reprobed con β-Spectrina anticorpi (capra) e visualizzato nel 800 canali. D. Terzo stripping e reprobing con l'anticorpo α-sinucleina (coniglio). E. Quarto stripping e reprobing con anticorpi ubiquitina (mouse) con 800 canali. C'è ancora rimanente segnale dall'ultimo anticorpi (α-sinucleina. Freccia arancione). F. Quinto stripping e reprobing con l'anticorpo CALB2 (coniglio) ripreso in 700 canali. Anticorpi secondari utilizzati sono stati: di capra anti-topo 800cw, 680rd capra anti-coniglio, capra 800cw anti-coniglio, asino anti-capra 800cw (vedi la lista dei materiali). Etichette di corsia: L – scaletta, 1/260; – campione 1/2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Luogo membrana (s) in un piatto quadrato Petri contenenti circa 30 ml di Revitablot spelatura e sono incubate tra 5-20 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante. Lavare la membrana (s) 3 volte in PBS poi ripetere la scansione sulla termocamera per garantire la rimozione completa della fluorescenza si è verificato – questo passo deve essere ripetuto dopo ogni striscia. Incubare membrana (s) per periodi più lunghi se fluorescenza rimane. Riscansiona la membrana dopo ogni striscia per confermare che non vi è alcun segnale secondario rimanente. NOTA: membrana (s) devono essere rimossi e reprobed un massimo di 3 volte per garantire l'integrità della membrana non è stata compromessa con conseguente elevato background indesiderabile per segnalare rapporto soltanto.