Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

Ce protocole a été optimisé en utilisant des tampons produits dans le commerce, des gels et des piles de transfert afin de réduire la variabilité et améliorer la cohérence. Reportez-vous à la liste de matériaux pour une liste complète des consommables nécessaires. Protocole WB fluorescent à l'aide I-Blot transfert rapide et LI-COR système d'imagerie Odyssey 1. Préparation de l'échantillon Sélection Tampon / préparation Sélectionnez un tampon d'extraction approprié pour l'homogénéisation et veiller à ce que le tampon est compatible avec toutes les techniques en aval à utiliser. Préparer un tampon d'extraction: un tampon RIPA (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, SDS 0,1%) contenant l'inhibiteur de protease de 5% cocktail avant l'isolement de l'échantillon. NOTE: Il existe de nombreux types de tampons d'extraction et la disposition sont choisis en fonction de la localisation de la protéine d'intérêt dans la cellule. Ceux-ci comprennent, mais ne sont paslimité à un tampon RIPA (cellules entières, des mitochondries et des composants nucléaires), NP-40 tampon de lyse (ou une membrane cellulaire lié ensemble) et Tris-Triton (cytoplasmique lié squelettique). Cependant, certains détergents chimiques à l'intérieur des tampons d'extraction peuvent aider à solubiliser ou même désactiver une protéine mais peuvent interférer avec le dosage des protéines en utilisant un dosage spécifique de la détermination des protéines, à savoir, l'acide Bicinchoninic (BCA). Vérifiez les recommandations du fabricant concernant la compatibilité chimique avec le dosage. L'extraction des protéines / solubilisation Macérer manuellement l'échantillon de tissu avec des ciseaux et / ou d'un scalpel, suivie par homogénéisation en utilisant soit un dounce ou un homogénéisateur électrique à main avec une pointe de polypropylène dans le tampon d'extraction préparés à environ 1h10 w v (poids de tissus de volume / tampon) / jusqu'à un homogénat lisse / cohérent est produit. NOTE: Pour les plus petits, précieux / difficile d'obtenir des échantillons, détergent à base extractions can encore être efficace jusqu'à 1: 5. Diffusez homogénéisation, centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 20 min à 4 ° C. Retirer le surnageant contenant les protéines solubilisées et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Conserver culots insolubles pour permettre une extraction plus plus strictes si nécessaire plus tard. Passez à l'étape de détermination de la protéine 1.3. Détermination des protéines Déterminer la concentration de protéine dans chaque échantillon extrait en utilisant soit une BCA, Bradford ou un dosage similaire. Lors du calcul de la courbe d'étalonnage, en sorte que le coefficient de détermination de rapport, la valeur de R au carré, est supérieure ou égale à 0,99 qui reflète la détermination plus précise de la protéine dans les échantillons abondance 15. REMARQUE: Tous les échantillons comparés par QFWB doit être testée par rapport à la même courbe standard. Préparation de l'échantillon Planifier et d'enregistrer l'ordre de chargement des échelles et des échantillons de 2 g identiqueEls: gel 1 pour le transfert et le gel 2 en tant que témoin de charge. Chargez le contrôle et les échantillons «traités» de manière séquentielle pour éviter tout biais qui pourrait survenir avec transfert pauvres ou sans équivoque. Calculer le volume de protéine requise pour chaque échantillon. Une charge de protéine standard pour détecter les protéines neuronales dans des isolats est de 15 mg. Faire de chaque échantillon à un volume de 10 pi avec dH 2 O. Ajouter 5 ul de tampon de charge, vortex et la chaleur à 98 ° C pendant 2 min. Inclure un échantillon de contrôle positif comme une protéine recombinante pour aider à l'identification de la bande correcte d'intérêt. Cependant préparer l'échantillon de contrôle positif correctement en suivant les directives du fabricant pour éviter la sélection des mauvaises bandes. Voir Figure 1. Figure 1. Psélection de commande ositive. L'ajout de contrôles positifs à une expérience confirme l'étiquetage détectée est réel. Cependant, des précautions doivent être prises pour assurer que votre commande fonctionne correctement avant d'utiliser les échantillons expérimentaux. A) La protéine de fusion TREM 2 a été chargé à les directives du fabricant de 1 ug / ml, mais le marquage observé à 110 conflits avec la fiche kDa prédit moléculaire poids de 60 à 70 kDa. B) Après addition et incubation avec l'agent réducteur, le marquage des protéines de fusion a été détecté au poids moléculaire prévu. Toutefois, cela signifie une plus grande charge de protéine est nécessaire que le processus de réduction a diminué le signal de la protéine. 2. Séparation électrophorétique des protéines Préparation de 4-12% gel Bis / tris (1,0 mm) REMARQUE: gels de gradient sont utilisés pour produire une plus grande séparation des protéines à travers une large gamme de poids moléculaire. Choisir et préparer MESou tampon de migration MOPS (1 L par réservoir) par dilution avec dH 2 O. Tampon MES donne une meilleure résolution des protéines à l'intérieur de 3,5 à 160 kDa alors que tampon de migration MOPS est préférée pour détecter les protéines de poids moléculaire supérieur à 200 kDa ci-dessus aura cependant moins bonne résolution des protéines de bas poids moléculaire inférieure à 15 kDa. Retirer le peigne et bande de ruban adhésif qui recouvre le pied du gel. Lavez délicatement les puits avec du tampon courante avec une pipette de 1 ml. Remplir les puits avec du tampon en cours d'exécution et assurent l'absence de bulles restent dans le gel. préparation de gel et de chargement Insérez les gels dans le réservoir et remplir le compartiment inter-gel avec le tampon en marche pour vérifier tous les joints sont efficaces. Ajouter 3 pi de standard de poids moléculaire dans le premier puits dans le gel et gel 1 2. Charge 10 pi de chaque échantillon dans les puits suivants. NOTE: À l'exception des échelles, gel 1 & 2 gel doivent être identiques. Il est impératif eà la norme de poids moléculaire pré-coloré utilisé pour le gel 2 est bleu et visibles en utilisant une tache de protéines totales afin d'être visible dans le canal de Odyssey 700 imageur. Une fois les deux gels sont chargés, remplir le réservoir avec le tampon de fonctionnement résiduelle et fermer le couvercle. Électrophorèse "Exécuter" le gel à 80 V pendant 4 min à assurer que l'échantillon pénètre dans la matrice de gel de polyacrylamide d'une manière uniforme. Par la suite, augmenter la tension et le temps de 180 V pendant 50 min, respectivement, jusqu'à ce que l'échantillon ou le colorant peut être vu au pied du gel. Remarque: Plus tensions peuvent être appliquées à raccourcir les délais d'exécution. Toutefois, cela peut entraîner des gels "smiley" où les échantillons du milieu des gels courir plus vite que les échantillons de voies extérieures causées par une augmentation de la température 14. 3. Total des taches de protéines du gel de commande de chargement gel de sortie 2 de la cassette à l'aideun couteau de gel. Retirer les puits et le pied du gel. Marquer le gel pour aider orientation. Décanter environ 30 ml de la tache de protéine dans une boîte de Pétri carré (taille d'environ 12 x 12 cm). Placer le gel 2 sur la tache de protéine, assurant la solution couvre la totalité du gel, puis agiter le gel pendant 1 heure minimum à la température ambiante pour colorer. Décanter la tache de protéines et laver les 3x de gel dans de l'eau distillée avant visualisation. Passez à l'étape 6.3 de visualiser. Protein 4. I-Blot semi sec Transfert rapide Remarque: Tous les réactifs nécessaires pour le transfert de la protéine à l'aide de la machine-Blot I sont des produits du commerce spécialement conçu pour la méthode I-Blot et peuvent être trouvés dans la liste de matériaux. Préparer le "fond" pile de transfert. Retirer le couvercle de papier d'aluminium et pré-humide avec un tampon directement dans le réservoir de gel en cours d'exécution. Papier filtre pré-mouillé avec de l'eau distillée. Répétez l'étape 3.1 et lieu gel 1 surle "fond" pile de transfert préparé. Poser le papier filtre pré-humide sur le gel. Rouler le papier filtre et gel pour garantir l'absence de bulles sont emprisonnées entre les couches. Retirez le couvercle de la pile de feuille de transfert haut et mettre la pile en haut au-dessus du papier filtre et la pile bas. Rouler la pile de transfert "sandwich" pour éliminer les bulles d'air. Insérez l'éponge du kit de pile de transfert sur le couvercle de la machine I-Blot. Placez le sandwich de la pile de transfert sur l'espace dédié sur la machine I-Blot puis fermer le couvercle en toute sécurité. Lancer la I-Blot et transférer 8,5 min sur le programme 3. Si il ya un signal faible en protéines ou inégales élevés: taux de protéines de faible poids moléculaire, de tester les temps de transfert du fabricant lors de l'utilisation d'une méthode semi sec "rapide" de transfert. Exécutez un protocole d'optimisation simple en utilisant des répétitions de charge identique d'échantillons pour déterminer la combinaison idéale transfert tension / temps comme le montre la figure 2 . Figure 2. Optimisation de transfert en utilisant le I-Blot. A) Gel seul chargé avec l'échelle et 15 pg de murin entier homogénat de cerveau à trois répétitions en tandem a été coupé en trois parties. Une partie n'a pas été transféré, une a été transférée pour 7,5 min (selon les directives du fabricant) et un pour 8,5 min. Les coupes de gel ont ensuite été colorées avec Instant Bleu protéine tache, numérisé sur un imageur infrarouge dans le canal 680 et quantifiés. B) Représentation graphique des valeurs de quantification qui démontrent la différence de teneur en protéine résiduelle de chaque gel suite à 0, 7,5, et 8,5 min de transfert. Notez qu'une minute supplémentaire de temps de transfert donné lieu à un transfert supplémentaire de la protéine d'environ 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 5. Anticorps détection de protéines Préparation de membranes et de blocage Retirez la pile de transfert de la machine I-Blot. Enlever la couche supérieure du papier filtre et l'exposition du gel sur la pile de transfert de fond. Couper autour du gel avec un scalpel et veiller à ce qu'une coupe triangulaire à des fins d'orientation est représentée sur la membrane. Après découpage de la membrane, de protéines tache le gel de vérifier l'efficacité de transfert et / ou les jeter. Déplacer rapidement la membrane dans un tube propre de 50 ml (ou un récipient équivalent) contenant 5 ml de PBS 1x et placer sur un rouleau mécanique (ou plate-forme orbitale) pour agitation constante. NOTE: Il est essentiel que la membrane ne soit pas autorisé à se dessécher. Pendant le transfert semi-sec de la membrane devient chaud. Attendez 2 min avant d'ouvrir la pile de transfert car cela permettra it à refroidir et le temps de séchage lent pendant pile déconstruction. Utilisation d'un rouleau et d'un tube d'agitation au cours de lavages et incubations permet de réduire sensiblement le volume de solution requis. Laver la membrane 3 x 5 min dans du PBS 1X. Jeter le PBS 1x et bloquer la membrane avec un tampon de blocage non dilué pour un minimum de 30 min à température ambiante. Préparation d'anticorps primaire. Préparer l'anticorps primaire selon les directives du fabricant de 5 ml de tampon de blocage avec 0,1% de Tween 20. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire préparée durant la nuit à 4 ° C avec agitation constante. NOTE: Le tampon de blocage est généralement utilisé non dilué, mais peut être dilué jusqu'à 1: 4 avec du PBS, si l'anticorps primaire a suffisamment de spécificité élevé. Jeter l'anticorps primaire et laver la membrane 6 fois pendant 5 min chacun avec PBS 1x. Sélection et préparation d'anticorps secondaire Pour secoNdary seule évaluation à des fins de contrôle d'étiquetage, omettre les étapes 5.2.1 et 5.2.2 ci-dessus et passez à l'étape 5.3 pour déterminer les profils de bandes secondaires spécifiques à l'échantillon. Voir la Figure 3. Figure 3. Optimisation des anticorps secondaires. A) Une comparaison des espèces multiples de seulement marquage non spécifique secondaire contre 15 ug de murin (M), la viande ovine (O) et équins (E) homogénats de tissu nerveux avec une variété de fluorescent marqué Anticorps secondaires . L est l'échelle de poids moléculaire. Broyat de tissu ovine était le seul échantillon de réaction croisée avec l'étiquetage secondaire lors de l'utilisation d'âne anti-chèvre 800 anticorps. B) Il est également important de vérifier si l'étiquetage est non-spécifique se produit lors de l'utilisation d'un échantillon de tissu différent, à savoir, jumeau murin muscle (15 _6, la charge g). Cet échantillon a une réaction croisée avec l'anticorps secondaire d'âne anti-souris 680, mais cela ne se produit pas lors de l'utilisation d'homogénat de cerveau de souris. Préparer le fluorescent marqué anticorps secondaire 680 ou 800 (rouge ou canal vert) suite fabricant concentrations recommandé dans un tampon de blocage avec 0,1% de Tween 20. Incuber la membrane dans l'obscurité avec l'anticorps secondaire préparé pendant 90 minutes à température ambiante avec agitation constante. Jeter l'anticorps secondaire et laver la membrane 6 fois pendant 5 min par lavage avec du PBS 1X. Passez à l'étape 6 – visualisation. Si la visualisation de marqueurs ne fonctionne pas comme prévu, les échelles d'examen avec une gamme d'anticorps secondaires comme une étape supplémentaire approprié. Tous les anticorps secondaires permettent pas la visualisation de toutes les bandes de marquage dans toutes les échelles disponibles dans le commerce. Si bandes attendues ne sont pas visibles, utilisez un hôte secondaire alternatif, à savoir, donkanti-lapin ey contre chèvre anti lapin représente une modification du protocole approprié. Voir Figure 4. Espèces hôtes utilisées pour élever un anticorps secondaire peuvent parfois causer un problème avec visualisation en raison du manque de spécificité des anticorps primaires spécifiques. Figure 4. dépannage anticorps secondaire spécificité de Western blot d'une série d'échantillons de tissus (protéine de 15 pg par piste.) – Graisse, le muscle, le foie et les os – incubées avec l'anticorps primaire ERK et incubées avec des anticorps secondaires trois différentes. Panneau supérieur: WB marqué avec LI-COR chèvre anti-lapin 680 anticorps secondaire produite faible étiquetage des gras et des os et aucun signal n'a été détecté dans les échantillons de foie et les muscles. Panneau central: Membrane (de haut) a été dépouillé et reprobed en utilisant la méthodologie ECL et de chèvre anti-lapin HRP liée secondaire. Bandes sont maintenant visibles dans les échantillons de muscle et de foie et l'étiquetage apparaît plus intense dans les échantillons de graisse et des os. Panneau inférieur: Membrane (à partir de panneau supérieur et moyen) a été dépouillé et sondé à l'aide LI-COR âne anti-lapin 680 anticorps secondaire qui a montré une plus grande affinité pour l'anticorps primaire ERK. Étiquetage pour les muscles et le foie est maintenant visible à une augmentation de l'intensité du signal à partir d'échantillons à la fois de la graisse et des os. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 6. Visualisation NOTE: Toutes les images sont acquises à l'aide de l'imageur LI-COR Odyssey classique et l'image associée logiciel d'analyse Pro (version 3.1.4). Tourner et se connecter à l'ordinateur et d'un imageur. Ouvrez le logiciel d'imagerie et de créer un nouveau fichier. Voir la figure 5. <p class="Jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> Figure 5. Visualisation et quantification de transfert de western. Numérisation d'un Western blot montrant muscle gastrocnémien murin (30 pg de charge) sondé avec un anticorps primaire annexine V (36 kDa) et de chèvre anti-lapin de 800 d'anticorps secondaire. La membrane a été numérisé et visualisé dans le canal 800. Pour quantifier la protéine (annexine V), une boîte rectangulaire est dessinée autour de la bande d'intérêt à partir de l'échantillon 1. Il est ensuite copié et collé sur les voies d'échantillons restants pour assurer une mesure de la même zone. Arrière-plan est représenté automatiquement autour de la forme dessinée, mais ce peut être modifiée pour assurer la mesure d'arrière-plan est définie avec précision. Le tableau ci-dessous présente les mesures chiffrées de chaque forme dessinée dont le signal total obtenu, fond et le signal de fond soustrait. Cette information peut ensuite être exporté dans untableur pour calculer des ratios d'expression (telle que déterminée par l'intensité relative de fluorescence) et permet des analyses statistiques complémentaires qui seront nécessaires. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Ouvrez le couvercle de l'imageur. Verser une petite quantité de PBS 1x sur le verre sur le coin inférieur gauche, puis placez la membrane sur le dessus de la PBS. Veiller à la membrane est de forme carrée avec l'axe de l'imageur et un espace de 1 cm est laissé entre la membrane et l'axe de la grille. Rouler la membrane pour assurer qu'aucun de bulles d'air entre le verre et la membrane. Comptez le nombre de places de la membrane occupe sur l'axe des x et y. Fermez le couvercle de l'imageur. Entrez le nombre de carrés de la membrane occupe sur le logiciel de l'ordinateur. Sélectionnez le canal approprié pour analyser la membrane qui dépendra du marqueur fluorescentde l'anticorps secondaire, à savoir 700 ou 800 canaux canal quand un anticorps marqué fluorescent 680 ou 800, respectivement, a été utilisé. Lorsque le double étiquetage est effectué, de numérisation dans les deux canaux. REMARQUE: Optimiser seul marquage de protéines avant d'effectuer le double étiquetage. Sélectionner l'intensité de balayer la membrane, si une protéine en forte abondance utiliser un balayage de faible intensité. Alternativement, si l'anticorps primaire a une mauvaise affinité pour la protéine d'intérêt Sélectionner un balayage d'intensité plus élevée, à savoir, niveau 5. Appuyez sur Start pour commencer la numérisation. Passez à l'étape 6.4. La visualisation du gel de commande de chargement (Figure 6). Figure 6. étiquetage des protéines totales et de l'analyse. A) Photographie d'une protéine gel totale marquée contenant 20 ug d'équine homogénat de ganglions cervicaux par voie. B) Gel de Groupe Anumérisée dans le canal 680 Graph. C) des mesures quantifiées de la protéine totale gel coloré obtenu en utilisant un logiciel d'imagerie. Une gamme de mesures déterminé par des marqueurs de poids moléculaire, c.-à-30-110 kDa, sont prises pour assurer un histogramme des mesures pour assurer erreur standard (SEM) est faible (des échantillons groupés) indiquant que les taux de protéines totales dans chaque échantillon sont uniformes à travers le gel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Suivez les étapes 6.1 et 6.2. Versez de l'eau distillée sur le verre dans le coin inférieur de l'imageur où l'axe de la grille commence. Placer le gel sur la surface de l'eau et de manoeuvrer ainsi les voies sont perpendiculaires l'une l'axe x ou y de la grille. Laisser un espace de 1 cm entre l'axe x et y de la grille et le gel et compter le nombre de carrés du gel occupe sur l'axe de grille. Prèsle couvercle de l'imageur. Entrez le nombre de places le gel occupe sur le logiciel de l'ordinateur. Sélectionnez le canal 700 pour balayer le gel de protéine colorées totale. REMARQUE: bleu fluorescent dans le canal 700. Réglez l'intensité à 5 et appuyez sur Start. Quantification de l'image numérisée Réglez les boutons de luminosité et de contraste pour produire la meilleure qualité d'image. Si il semble y avoir un bruit de fond élevé, relecture de la membrane à une intensité plus faible et utiliser le réglage de la numérisation de haute qualité. NOTE: Les ajustements ne modifient pas les données fluorescentes acquises lors de la numérisation. Faire pivoter les images de 90 °, 180 ° et 270 ° afin de voir dans l'orientation souhaitée sans modification des données acquises. Cependant, lors de petits ajustements de l'orientation en "rotation libre", par plus de 3 °, les données acquises dans les valeurs de pixilation peuvent se déformer et ainsi affecter les résultats de quantification. Sélectionnez une forme dans le menu de formes – utiliser un rectangle dans la plupart des cas – et d'en tirer autour de la bande d'intérêt (BM) ou le passage en entier (gel de protéines totales) dans l'échantillon voie 1. Copiez et collez la forme à travers de l'échantillon voie 2 bande d'intérêt ou toute voie. Répéter à travers chaque bande d'intérêt pour chaque échantillon et chaque voie pour le total des gels de protéines. Vérifiez que la mesure de fond ne comporte pas de signal dans la voie d'à côté. Le fond peut être déduite automatiquement par le logiciel et englobe bord entier autour de la forme dessinée ou il peut être spécifié à être haut / bas ou à gauche et à droite de la forme. Sinon, désigner une boîte de fond définie par l'utilisateur. Afficher le signal de la table de formes pour chaque forme dessinée en unités de fluorescence arbitraires. Le fond sera automatiquement déduit à partir du signal. Exporter l'image comme un fichier TIF à voir dans un autre logiciel. Ne pas exporter l'image et manipuler using non l'image pro logiciel que ceci modifie les données originales acquises par l'imageur générer de fausses données. Répétez les étapes 6.4.3-6.4.7 lors de la quantification double étiquetage ou la mise en oeuvre des mesures multiples sur des gels de contrôle de chargement pour générer et compiler les données d'erreur standard. 7. Publier visualisation Gardez membranes en 1x PBS ou sécher pour le stockage à long terme pour l'avenir de re-sondage et le décapage de membranes pour d'autres protéines d'intérêt. Décapage et re-sonder des membranes. Voir la Figure 7. Figure 7. Membrane de décapage et reprobing. Des exemples représentatifs de membranes suivant différentes étapes de décapage numérisées avec un système d'imagerie infrarouge. A. La première immunodétection a été réalisée avec l'anticorps primaire CSP (lapin) et balayé à 700 canal. B. Première décapage et reprobing avec ROCK2 (lapin) avec 800 canaux. Flèche orange indique restant CSP anticorps primaire présente après la bande et re-sonde. Cela ne porte pas atteinte à la mesure de ROCK2 que le groupe est présent à un plus haut poids moléculaire (flèche blanche). C. Deuxième décapage et sondé avec β-spectrine anticorps (chèvre) et visualisées dans le canal 800. D. Troisième décapage et reprobing avec l'anticorps α-synucléine (lapin). E. Quatrième décapage et reprobing ubiquitine avec l'anticorps (de la souris) avec 800 canaux. Il est toujours en restant signal de la dernière anticorps (α-synucléine. Flèche orange). F. Cinquième décapage et reprobing CALB2 avec un anticorps (de lapin) imagé dans le canal 700. Les anticorps secondaires utilisés étaient: chèvre 800CW anti-souris, chèvre anti-lapin 680rd, chèvre anti-lapin 800CW, âne anti-chèvre 800CW (voir la liste des matériaux). étiquettes de Lane: L – échelle, 1/260; – échantillon au 1/2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Placer la membrane (s) dans un plat carré de Petri contenant environ 30 ml de tampon de décapage Revitablot et sont incubés entre 5-20 min à température ambiante sous agitation constante. Laver la membrane (s) 3 fois dans du PBS puis rescanner sur l'imageur à assurer l'élimination complète de la fluorescence a eu lieu – cette étape doit être répétée après chaque bande. Incuber membrane (s) pour des périodes plus longues si fluorescence reste. Relecture de la membrane après chaque bande pour confirmer qu'il n'y a pas de signal secondaire restant. REMARQUE: Membrane (s) ne doit être retiré et sondé un maximum de 3 fois afin de garantir que l'intégrité de la membrane n'a pas été compromise résultant dans un bruit de fond indésirable à signaler rapport.