The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
סוף 1970s ראה השימוש דיווח בפומבי הראשון של הכתם המערבי, טכניקה להערכת הנוכחות ושפע יחסי של חלבונים ספציפיים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. מאז, מתודולוגיה המערבית סופג הפכה למרכיב נפוץ ברפרטואר הניסיוני הביולוגים המולקולריים. חיפוש שטחי של PubMed שימוש במונח "כתם מערבי" עולה כי בעודף של 220,000 כתבי יד שפורסם עשו שימוש בטכניקה זו עד שנת 2014. חשוב לציין, בעשר השנים האחרונות ראו התקדמות הדמיה טכנית בשילוב עם הפיתוח תוויות ניאון של רגישות אשר שיפרו את הרגישות והניבה טווחים גדולים עוד יותר של גילוי ליניארי. התוצאה היא הקרינה עכשיו באמת לכימות מערבית כתם (QFWB) מבוססת המאפשרת לביולוגים לבצע ניתוח ביטוי השוואתי עם רגישות רבה יותר ודיוק מאשר אי פעם בעבר. מערבי סופג "אופטימיזציה" רבמתודולוגיות קיימות ונמצאות בשימוש במעבדות שונות. לעתים קרובות להוכיח אלה קשים ליישום בשל הדרישה של תיקונים פרוצדורליים עדינים אך מתועדים. פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של שיטת QFWB הוקמה וחזק, מלא באסטרטגיות לפתרון בעיות.
מערבי סופג (WB) היא טכניקת ניתוח שפותחה במקור בסוף 1970s כדי לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון של עניין במדגם ביולוגי מורכב, כגון רקמת homogenate 1. המכונה גם immunoblot החלבון, כתוצאה מאינטראקצית הנוגדן-אנטיגן מפתח, המתודולוגיה כוללת 5 שלבים ברורים: 1) הפרדת electrophoretic של החלבונים על ידי נקודת isoelectric; העברה לdifluoride nitrocellulose או polyvinylidene (PVDF) קרום 2); 3) תיוג באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין; דגירה 4) עם נוגדנים משני המכוונים נגד הנוגדן הראשוני; ו -5) להדמיה.
המתודולוגיה הדמיה התפתחה עם זמן לשיפור בטיחות ורגישות. חלק מWBS הראשון בוצע באמצעות תגי כותרת רדיו אשר לאחר מכן התקדמו לcolorimetric ולאחר מכן chemilluminescent יותר בשימוש נרחב בשיטות (ECL). Radioactivity תויג ישירות על גבי בדיקות לאנטיגנים ספציפיים ואילו שיטות colorimetric וECL להשתמש בטכניקת תיוג עקיפה עם כתב אנזים כגון peroxidase אלקליין חזרת phosphatase או streptavidin (HRP) 2. העצמה של תיוג של מוצר כרומגן או זורח נמדדת באמצעות צפיפות לפי עוצמת האות, חזקה או חלשה, מציינת פחות או יותר את נוכחותו של החלבון של עניין במדגם. ECL הוא מתודולוגיה רגישה יותר ולכן העדיפה 2 אבל כל 3 השיטות בתחילה פותחו על סרט X-ray עם טכניקות הדמיה דיגיטלית מתוחכמות יותר הוקמו 3 לאחר מכן. הקידום של הדמיה הדיגיטלית של WB אפשר לא רק חוקר על מנת לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון עניין שלהם, אלא גם אפשר היקש לרמת ביטוי של חלבון שנבחר בהשוואה נגד דוגמאות אחרות, ולכן יכול להיות המכונה "חצי כמותית & #8221 ;. לאחרונה, טכנולוגיה מערבית סופג באמת כמותי ורגישה יותר פותחה לפי רמת הקרינה שנמדדה קשורה באופן ישיר לכמות ולביטוי של חלבון בודד בתוך מדגם: כמותיים ניאון מערבי סופג (QFWB).
כאשר משווה QFWB עם תיוג ECL, השימוש בנוגדנים משני ניאון יוצר פרופיל איתור ליניארי 4. זאת בניגוד לטכניקות ECL בי ליניאריות אות מתרחשת בדרך כלל עם המון חלבון נמוך מתחת מיקרוגרם 5 ואת הרוויה אות קשורה ישירות לביטוי חלבון, כלומר, עם גני המשק באו לידי ביטוי בכל המקום 5,6. פער זה בא ככל הנראה נגרם על ידי מספר גדול יותר של אתרי קישור זמינים עבור מצע ECL avidin להיקשר לbiotinylated משנית, וכתוצאה מכך סבירות גבוהה יותר של הרוויה אות פוטנציאלית. זה אחת הסיבות העיקריות לimmunoblotting בסיס ECL שהופנה לonl כ7 y "חצי כמותית". הנקודה של אות רוויה היא בעל חשיבות קריטית כאשר מודדים הבדלים דקים ברמות ביטוי ויכול להוביל למדידה לא מדויקת. בשנים האחרונות הכניסה של טכניקות proteomic נרחבות המפרטות את הרגישות והזדהות של הפרשי ביטוי עדינים הולכת וגוברת הביאה הסתמכות הולכת וגוברת על מערבי סופג באמת כמותי לניסויי אימות 8,9. היישום של מתודולוגיה רגישה, חזקה ובאמת כמותי ולכן, חשוב.
מתודולוגיות מערביות סופג "אופטימיזציה" רבות כבר מנוצלות על ידי מעבדות עצמאיות, אשר לעתים קרובות להוכיח קשה להגדיר או לשכפל בשל התאמות מתודולוגיים עדינות שלא יכול להיות ברור בפרוטוקולים מתועדים רשמיים. זהו פרוטוקול מבוסס וחזק לQFWB ובנוסף מספק אסטרטגיות חשובות לפתרון בעיות נפוצות thaלא יעלה במהלך ביצוע.
פרוטוקול זה היה מותאם במקור לשימוש עם homogenates המוח עכברית, אך מאז נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של דוגמאות ומינים 4,9,10 רקמה. וריאציות פרוטוקול פוטנציאל הנדרשות לפתרון בעיות ספציפיות כלולות.
שיקול ותכנון בשל חיוני לפני כל ניסוי וסופו של דבר יכול לקבוע את ההצלחה של הטכניקה המשמשת. ההתקדמות בזיהוי חלבון באמצעות WB יכול להציג שפע של מכשולים פוטנציאליים כאשר מנסה לבחור את הנוגדנים, ששיטות העברה וההדמיה המתאימות לשימוש. למרבה המזל, באמצעות רשימת בדיקה זהירה ואמצעי בקרה מתאים QFWB ניתן להשתמש באופן שיגרתי כדי לקבוע נוכחות חלבון והבדלי ביטוי עדינים יותר ויותר בין דגימות. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לסופגים ניאון כמותיים מערבית, כמו גם כמה אסטרטגיות לפתרון בעיות, כדי למנוע ו / או להתגבר על חלק מהמכשולים נפוצים הרבים הקשורים אליו.
השלבים הקריטיים המועסקים כדי לשמור על רגישות ולקבל באמת מדידות לכימות והשוואה כוללות: 1) מיצוי חלבון חזק מדגימות רקמה; 2) הכנת מדגם; 3) loadin חלבון מדויקז שנקבע על ידי סך הכל ניתוח חלבון; 4) העברה אופטימלית של חלבונים באמצעות I-כתם; 5 הכנה) של נוגדנים ראשוניים ומשניים בחסימת מאגר המכיל 0.1% Tween20, ו -6) להדמיה נכונה וניתוח באמצעות תרמי אינפרא-אדום ותוכנה נלווית.
זיהוי ניאון אינפרא אדום הוא באמת כמותי ומספק רגישות רבה יותר בהשוואה לטכניקות מסורתיות יותר ECL זיהוי 3,11. מערכת זיהוי זה היא רב פנים, ובתור שכזו אינה מוגבלת לQFWB. מערכת זו היא מסוגלת הדמיה של תיוג immunohistological בהספק נמוך המאפשר הדמיה וכימות של חלקי רקמות שלמים 12. זה תחום אחד של פיתוח עתידי פוטנציאלי במונחים של רזולוציה שיכל לראות הדמיה רחוקה אדומה התחרתה לכידת immunofluorescence קונבנציונלי עם מיקרוסקופים קונבנציונליים במונחים של הערכה כמותית.
עם זאת, עם רגישות רבה יותר לשינויים עדינים בעמ 'rotein ביטוי הוא חיוני כדי להבטיח שונות נשמר לאמצעים מינימליים ושליטה הם מחמירים עם פרוטוקולים חזקים. זה מתחיל בהפקת חלבון מחמירה מדגימת הרקמה ואחריו ייצור כולל ג'לי חלבון מוכתם לספק ביטחון כי טעינת מדגם אחידה, אופטימיזציה של נוגדנים ראשוניים ומשניים, על מנת לקבוע אם זיהוי הוא אמיתי ובדיקת ההנחיות של היצרן בכל קשור להעברה פעמים כדי לקבל העברת חלבון יעילה.
עם זאת, גם כאשר תנאים לWB מותאמים, ייתכן שעדיין בעיות הקשורות לניהול מערבונים שאולי לא נחקרו במלואו כאן. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים לגורמים, כולל solubilization חלבון ובחירה של חיץ חילוץ. מאגרים מסוימים יכולים להפריע למבחני ריכוז חלבון, וכמה רקמות קשות במיוחד לsolubilize, הדורש טכניקות חזקות יותר כגון השימוש בmacera האוטומטיטינג אטום מכולות כגון צינורות יחד M עם Dissociator מקינטוש. בנוסף, אמצעי בקרה פשוט לאחסון של חומר שחולץ ולא חולץ ב -80 מעלות צלזיוס יכול להיות ההבדל בין קבלת תיוג אופטימלי מייד לאחר חילוץ ויש להם שבועות תוצאות עניים מאוחר יותר.
שיטות QFWB מודרניות הוכיחו להיות רגיש יותר ללכידת הבדלים דקים בביטוי חלבונים ויותר תכליתיים המאפשרות תיוג כפול בו זמנית 3 בהשוואה לטכניקות ישנות יותר כגון ECL. זה חיוני כי פרוטוקולים מערביים סופג הם חזקים וקלות שחזור לכימות מדויק וניתוח סטטיסטי. פרוטוקול זה הוא רגיש וחזק מספיק כדי לשמש באופן שגרתי לגילוי של חלבונים על פני מגוון רחב של דגימות רקמה שונות ומינים 3 ומאפשר כימות של חלבוני שפע נמוכים וגבוהים בתוך אותו QFWB לכן הפחתת שימוש מתכלה כמו גם זמן לניסוי 1. 1 בנוסף, הרגישות המוגברת של טכניקה זו מאפשרת אימות של יותר ויותר פופולרי – מחקרי omic 9,14 עם זאת דיוק הוא קריטי והכללת אמצעי בקרה המתאימה יש לדבוק בהימנעות רכישת נתונים שגויה כך.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכל הבאים לתמיכה כספית: BBSRC המכון אסטרטגי תכנית מימון – CF וTMW; מימון BBSRC מזרח Bio DTP – LG; אמון דרווין של אדינבורו – MLH. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר בארי McColl רשות כוללת אופטימיזציה TREM2 בכתב היד הזה.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |