단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양
Özet
Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Abstract
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Introduction
현탁액에서 성장 세포 응집체로서 세포 성장 및 세포 기질에 고정 성장 : 포유류 세포 선은 그들의 성장 특성에 따라 세 개의 카테고리 중 하나로 분류 될 수있다. 이 비디오에서 보여준 공기 륜 생물 반응기는 세포의 세 가지 유형을 성장할 수 있지만,이 비디오는 마이크로 캐리어에 고정 장치 의존 세포를 성장하는 생물 반응기의 사용을 설명합니다. 세포 자체 산물 – 앵커리지 종속 포유류 세포보다 세포를 생산하기위한 목적으로 성장시킬 수있다. 예를 들어, 인간의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포는 현재 세포를 수확하고 병든 조직으로 이들을 주입 목적으로 재배되고있다. 이 동영상에서 입증 공압 생물 반응기가이 애플리케이션에 대한 이러한 중간 엽 줄기 세포의 제조에 적합한 입증되었다 (세라 외., 개인 통신, 2013).
앵커리지 출발endent 포유 동물 세포는 일반적으로 그들이 특별하게 취급 성장 표면에 부착 한 세포 배양 접시, 세포 배양 플라스크, 또는 롤러 병으로 2D 배양 용기에서 작은 규모의 성장하고 있습니다. 이상의 셀이 요구되는 경우, 플레이트 또는 플라스크 개 이상의 용기를 사용하여 확장 될 수있다. 그러나,보다 비용 효율적인 앵커리지 의존적 세포의 대량 배양, 세포 부착을위한 표면적을 증가시키기 위해 마이크로 – 고체 담체라는 작은 비드를 사용하여 수행 할 수있다. 세포의 부착 특성에 따라, 마이크로 캐리어의 여러 다른 유형의 코팅 된 덱스 트란과 같은, 펩타이드, 콜라겐과 같은 시판 중이다. 마이크로 캐리어는 세포 성장을위한 큰 표면적을 제공 부피비 큰 표면적을 갖고; 및 마이크로 캐리어 세포 바이오 리액터 시스템이 높은 밀도로 배양 할 수 교반과 현탁액에서 유지 될 수있다. biorea의 현재 형식부착 세포는 마이크로 캐리어에 성장 ctors 셀 코팅 마이크로 캐리어들의 현탁액을 유지하기 위해 축 방향 임펠러를 사용하여 스피너 플라스크 및 교반되는 탱크 시스템을 포함한다.
여러 가지 요인 산소 장력, 전단 응력, 표면 행렬, 영양소 및 대사 산물 농도를 포함한 세포의 배양에 성공에 중요하다. 생물 반응기의 사용은 실시간 성장 조건의 모니터링 및 상당히 낮은 생산 비용 1 전위 허용한다. 를 포함하여 체외 세포 배양, 교반 서스펜션, 회전 벽 용기, 중공 섬유, 로커 플랫폼에서 가방 생물 반응기, 유동층 시스템 3에 대한 몇 가지 일반적인 생물 반응기 설계가 있습니다. 이들 시스템의 대부분은 높은 비용, 영양소 농도 기울기, 유체 역학적 전단력, 세포 응집 어려움 샘플링에서, 모니터링 및 제어 CEL 같이, 세포 배양을 위해 고유의 문제를 제시하고 – 최대 스케일리터 규모입니다.
다양한 점착성 세포주 바이러스 백신의 제조 또는 유전자 치료 응용을위한 바이러스 벡터의 제조 중, 바이러스의 생산에 사용된다. 이 비디오에서는, 단일 사용 공기 (에어 휠) 생물 반응기 시스템을 사용하여, 우리는 인간의 폐암 세포 (A549) 콜리 틱 아데노 바이러스의 생산을위한 마이크로 캐리어에 세포의 문화를 보여줍니다. 공압 생물 반응기 설계는 생물 반응기의 바닥으로 살포 기체의 부력에 의해 구동되는 수직 교반 휠을 사용한다. 이 부드러운 교반 방법은 유체 역학적 전단력을 제한하지만 여전히 최적 배지 및 세포가 4를 혼합 보장한다. 교반 탱크 반응기에 비해, 공기 반응기 심지어 대용량 에어 휠 바이오 리액터 시스템 (도 1)와 낮은 벽 전단 응력을 갖는다. 교반 탱크 생물 반응기는 대조적으로,이 단일 사용 반응기의 수직 임펠러는 기포의 스트림 내에서 켜져부드럽고 균일 한 매체의 혼합 (그림 2)을 허용 용기.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 회용 바이오 리액터 시스템은 사용하기 비교적 간단하고 반응기 모니터링 및 분석을위한 실시간 분석을 제공한다. 그것은 매우 잘 천만명 이상의 세포 / ml에 도달 한 세포 밀도가 포유 동물과 곤충 세포 배양에 적합하다. A549 세포는이 보고서 11에 설명 외에, 우리는뿐만 아니라 생물 반응기에서 SF-9 곤충 세포를 성장했다. 공압 공기 휠이 제공하는 부드러운 혼합 세포 손상을 줄일 수 있습니다. 이 반응기를 설정할 때 몇 가지 단계가 중요하다. 첫째, 적절한 산도의 교정 및 센서는 문화의 최적의 모니터링 및 산도 또는 시스템의 산소를 조절 시약을 첨가 한 중요 않습니다. 둘째, 시약 및 종자 병이 채워지고 루어 첨부는 BSC로 무균 환경에서 이루어져야한다. 시약 병은 무균 환경에서 벗어나게되면, 생물 반응기 공급 라인의 연결은 미생물이 오염되지 않도록주의해야합니다.
<p클래스 = "jove_content">이 생물 반응기 시스템이이 박테리아 배양을 위해 설계되지 포유 동물과 곤충 세포주 잘 작동하는 동안. 시스템은 세균 세포에 필요한 산소와 급속한 혼합을 제공 할 수 없다. 세균의 성장에 가장 교반 탱크 생물 반응기에서 수행됩니다. 포유 동물 또는 곤충 세포 배양에 대한 다른 일회용 바이오 리액터에 비해,이 시스템은 사용하기 쉽고 실행의 분석을 위해 충분한 데이터를 제공하고, 우리가 평가 한 다른 단일 사용 시스템보다 비슷하거나 더 나은 세포의 성장이 있습니다.회용 바이오 리액터 공압 시스템은 세포를 연구 biotherapeutics, 백신의 임상 응용 분야에서의 여러 줄기를 충족 할 가능성, 및 개인화 된 약 4를 갖는다. 또한,이 시스템의 유연성은 배치, 회분, 관류 및 형질을 기반으로 생물 반응기 애플리케이션 다섯 수 있습니다. 마지막으로, 단일 사용 회용 바이오 리액터 시스템이 poten대규모 산업 생산의 요구를 충족하고, 가이드 라인과 국내 및 국제 규제 기관 6-10의 권장 사항을 준수 자유형.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS 3 | PBS | n/a | |
| Single Use Assembly | PBS | n/a | |
| Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
| DMEM High Glucose Medium | |||
| Fetal Bovine Serum | |||
| Trypsin EDTA, 0.25% | |||
| Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
| Antifoam C | Sigma | A8011 |
Referanslar
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