Unilateral Pyramidotomy do Corticospinal Tract em Ratos de Avaliação de Terapias de indução de neuroplasticidade

As taxas de sobrevivência. Em um estudo representativo realizado por nós tivemos uma taxa de sobrevivência de 16 dos 20 ratos fêmeas encapuzados Lister (200-250 g). A complicação mais comum é a respiração dificuldades por causa do deslocamento da traquéia ou danos aos centros respiratórios no tronco cerebral apenas dorsal para as pirâmides (solitarii núcleo, ambíguas e parabrachilis). Resultados semelhantes têm sido relatados na literatura 16. Resultados comportamentais. Uma série de testes comportamentais foram utilizados para avaliar o resultado sensório-motora após pyramidotomy em roedores: o teste de escada horizontal, o único pelete atingir teste, o teste de criação cilindro e teste em escada Montoya são as avaliações comportamentais mais vulgarmente utilizados. Outros testes descritos na literatura são o pellet atingindo teste, teste de corda de escalada, análise de marcha eo teste de fita adesiva3,17-19. A maioria destes mostram um déficit motor funcional uma semana após a lesão. Atualmente, a maioria dos estudos descritos na literatura apenas realizar o teste comportamental até 42 dias 4,11,13,20,21, ou por um período mais curto 3,18,22. Realizamos testes de comportamento durante um período prolongado de tempo e ter visto essencialmente completa recuperação da função motora das 8 semanas após pyramidotomy para alguns dos testes comportamentais, excepto o teste de escada e o ensaio de Montoya escada horizontal. Este é provavelmente por várias razões. Em primeiro lugar, o rostral CST feridos para a lesão pode formar sinapses nos neurônios no tronco cerebral que atuam relés como indiretos para os neurônios motores na medula espinhal. Em segundo lugar, o ileso (contralateral) CST pode brotar e formas sinapses nos neurônios no tronco cerebral ou da medula espinhal que atuam como relés para os neurônios motores. Em terceiro lugar, outros tratos motores poupados, como os tratos reticulospinais, vestibuloespinais ou rubroespinais pode assumir alguma função. Assim, uma duração tratamento efeito é difícil de detectar, com muitos testes comportamentais no modelo pyramidotomy. Alguns testes de comportamento neste modelo, porém, poderia indicar uma recuperação acelerada cedo após a lesão, o qual está relacionado com um tratamento. Teste do cilindro Empinar 3,4,23 Com base no teste de criação de cilindro a CST correspondente ao forepaw dominante foi ferido. Os ratos são colocados em um cilindro de plexiglass e comportamento de criação é observado por um período de 3 min. Preinjury houve uma ligeira preferência pelo uso de uma pata, da pata dianteira dominante, durante a exploração vertical (Figura 3A). A lesão afeta o lado dominante e o uso da pata dianteira contralesional diminuiu para 28% em 1 semana Medidas postinjury (repetidas ANOVA, p <0,05; teste post-hoc revelaram animais têm défices significativos na semana 1, 2 e 3, p <0,05, LSD de Fisher). 4 semanas postinjury os animais recuperaram umd usou o membro anterior afetada por 45% das traseiras, e depois de 6 semanas esta foi de 57% (n = 16, média ± erro padrão é mostrado). Camundongos Da mesma forma, Starkey et al. (4), avaliada pelo teste de cilindro para até 42 dias após pyramidotomy e relataram uma diminuição significativa no uso da pata dianteira afetada ao longo de todo o período de testes. Teste Montoya Staircase 24 Rats exigem pré-treinamento para este teste para aclimatar antes da lesão. Para aumentar a motivação durante os animais sessão de testes são restrição alimentar de 15 g de alimentos por rato na noite anterior. Os ratos privados de alimentos são colocados na escadaria Montoya durante 15 min. Em cada lado, existe uma escada de sete passos, com poços, cada um contendo três peletes. O número total de pelotas recuperados de cada lado são registados. O número de pelotas recuperados com o / forepaw afetados contralesional diminuiu significativamente de 61% para preinjury3% 3 dias postinjury (Figura 3B). A capacidade de recuperar pelotas ainda estava significativamente prejudicada em 4 semanas postinjury com 20% de pelotas recuperados. Ratos mostram um déficit significativo até a semana 8 com apenas 29% das pelotas comido naquele ponto do tempo (medidas repetidas ANOVA p <0,05, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos no lado contralesional em todas as semanas, p <0,05, Fisher LSD). O forepaw ipsilesional é afetada até 1 semana postinjury; no entanto, este recupera até a segunda semana (Medidas repetidas ANOVA p <0,05, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos no dia 3 e Semana 1 na pata dianteira ipsilesional, p <0,05, de Fisher LSD). Os déficits iniciais do forepaw ipsilesional pode ser explicado pela a lesão da porção ipsilateral do trato corticoespinhal executando através da pirâmide cortada, com o surgimento e posterior recuperação. HorizontalTeste Ladder 25 Rats exigem pré-treinamento para este teste. Rats caminhar três vezes ao longo de um 1 m de comprimento, com espaçamento de escada degrau irregular. Os vídeos são analisados ​​mais tarde em câmera lenta e o número total de pé escorrega e erros para cada pata é quantificado. O gráfico da Figura 3C representa o número total de falhas e lapsos de lado afetado e menos afetados (forepaw + pata traseira), em percentagem do número total de passos dados. Os ratos têm um aumento significativo do número de erros de uma semana postinjury com 10% ou 11% sobre o lado afetado e do lado menos afetado respectivamente. Esse déficit é persistente na / no lado afetado contralesional até a semana 8 com 10% de erros fez, no entanto, deliberar sobre a / lado menos afetado ipsilesional por duas semanas (ANOVA para medidas repetidas, a análise post hoc revelou animais têm déficits significativos em todas as semanas na o lado contralesional e déficits significativos na Semana 1 e 3 no ipsilesionallado, p <0,05, de Fisher LSD). Testes eletrofisiológicos Em um terminal eletrofisiológico de set-up o animal foi anestesiado por via intraperitoneal com uretano. Durante todo o procedimento, que foi mantida a 37 ° C ± 1 ° C. Sua região ventral do pescoço, os seus membros anteriores e região torácica foram raspada e desinfectados com iodo matagal. As pirâmides foram expostos como previamente descrito e do nervo radial foi exposto na parte superior do braço por uma abordagem ventral incisão na pele e o músculo peitoral maior. A extremidade distal do nervo radial foi cortado e o nervo foi colocada sobre dois gancho-eléctrodos de prata-fios em um banho de óleo mineral. De qualquer pirâmide foi estimulado com eletrodos bipolares concêntricos em diferentes profundidades com 5 pulsos a 300 Hz e aumento da amplitude de estimulação. As gravações foram sempre feita a partir do nervo radial do braço deficientes (Figura 4). Anim ilesoals teve uma resposta forte em latências entre 12 a 20 ms de nervo radial quando a pirâmide contralateral foi estimulada (Figura 4B). Estimulação ipsilateral só resulta em activação ocasional (Figura 4C). Os animais que receberam previamente pyramidotomies, no lado contralateral ao braço de gravação não mostram resposta do nervo radial quando o tracto lesionada é estimulada por cima da lesão (Figura 4B '). No entanto, a estimulação das fibras de TCS em que as pirâmides ipsilateral à gravação eléctrodos resultou numa forte activação do nervo radial em comparação com os animais lesionados com 12 semanas postinjury (Figura 4C). Resultados anatômicos. Os animais foram sacrificados 10 semanas após a cirurgia de acordo com o Anexo 1 dos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Duas semanas antes, o CST ileso foi traçado com biotiniladodextrano amina (BDA) injecções no córtex motor 26 ipsilateral ao braço deficientes (Figura 1). Isso permite a quantificação de fibras não lesadas, que atravessam a linha média e abastecem a medula espinhal contralesional (Figura 5C, D). Animais não lesadas têm apenas algumas fibras que atravessam a linha média, e que esta aumenta em resposta à lesão. Secções da espinal medula cervical transversa foram marcadas com a proteína quinase C (PKC) gama para avaliar a proporção de desnervação na CST lesionado (Figura 5E) 16. Alternativamente, a integralidade da lesão pode ser avaliada através da injecção de BDA traçador no córtex motor, no lado da lesão ipsilesional pyramidotomy. A falta de rotulagem no contralateral dorsomedial CST ea ipsilateral ventromedial CST fornece evidências de transection unilateral completa. <img alt="Figura 1" fo:conte nt-width = "src" "4in" = "/ files / ftp_upload / 51843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" /> Figura 1: Diagrama esquemático mostrando o trato corticoespinhal no rato e axotomia unilateral da CST nas pirâmides Top imagem:. Neurônios corticospinais originam nas células piramidais da camada 5 corticais. Amina dextrano biotinilado (representado em verde) é injectado no córtex contralesional duas semanas antes do fim da experiência. Imagem secundária: Os intervalos formam as pirâmides na superfície ventral da medula e na junção raquimedular a maioria dos axónios decussate. Pyramidotomy unilateral é realizada na medula caudal (mostrado em vermelho). Imagem Lower: A maioria dos tratos corticospinais descem nas partes dorsomedial e dorsolateral da medula espinhal. Uma minoria permanece ipsi e corre ventromedially. "Width =" 1843fig2highres.jpg 500 "/> Figura 2: Vista ventral do cérebro de rato. As pirâmides são distintos, porque eles são levantadas, convexities paralelas (caixa amarela). As fronteiras das pirâmides são definidos medialmente pela artéria basilar (BAS) sobre a linha média lateralmente e na base da convexidade a meio caminho entre a artéria basilar e a artéria paraolivary (pol) como pode ser visto em (C). Craniotomia é realizada sobre a artéria basilar e laterais estendendo-se até a artéria paraolivary (caixa vermelha na C). Uma pirâmide é cortado perpendicularmente à artéria basilar (linha vermelha em C, é mostrada em corte na amostra A e B). Lesões colocados também caudally perto das artérias vertebrais (vert) será incompleto porque a CST começa a decussate e porque a artéria vertebral é ajustado fora da linha média. (C) Imagem adaptado de "O Sistema Nervoso Rat", de George Paxinos 27. NOTA: Esta figura mostra uma lesão no lado esquerdo das imagens: este é o equipamento do animalht via piramidal porque está deitado de costas. Observe, porém, que o vídeo mostra uma lesão de esquerda via piramidal do animal. Figura 3:. Os resultados representativos para o teste de criação de cilindro, Montoya escadaria pellet chegando e teste de escada Horizontal Há um déficit motor detectada por todos os testes após a lesão. No entanto, nenhum défice pode ser detectado com o teste do cilindro criação em 4 semanas postinjury, enquanto que os défices sustentada pode ser detectado com o teste em escada Montoya e o teste de escada horizontal até 8 semanas postinjury (n = 16 por grupo, os meios e o desvio padrão são mostrado). Asterisk indica p <0,05 em relação à linha de base preinjury (teste de LSD de Fisher). Por favor, cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4:. Eletrofisiologia avaliação do trato corticoespinhal antes e depois pyramidotomy (A) mostra o set-up para o experimento terminal. Estimulamos as pirâmides com um trem de 5 pulsos em várias profundidades rostral ao site de a lesão e decussation. O trato vermelho é o trato lesionado. Nós gravar a partir do nervo radial no lado contralesional. (B) e (C) mostram exemplos gravados com estimulação ipsilesional ou estimulação contralesional antes ou 12 semanas após pyramidotomy. Estimulações Ipsilesional evocar vários potenciais de ação composto (picos no rastreamento) no nervo radial antes da lesão (B). Estes são abolidos pela lesão e atividade não return dentro de 12 semanas (B '). Estimulação contralesional evoca rara potenciais de ação composto único preinjury (C). 12 semanas após a atividade lesão é aumentado consideravelmente (C '), possivelmente devido à axônios intactos brotando através da linha média e plástico mudanças dentro da medula espinhal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5:. Anatómico avaliação após pyramidotomy (A, B, C, D) amina dextrano biotinilado foi utilizado para rastrear o trato corticoespinhal, injectando-o no córtex motor correspondente à CST não lesionado (ver verde na Figura 1). A medial dorsal, os componentes ventral medial da CST são claramente visíveis (A, medial dorsal parte ampliada em B). (C) e (D) são ampliações de (A) de fibras de germinação através da linha média para a matéria cinzenta do lado desnervado em resposta a um tratamento. Para avaliar o preenchimento das secções transversais da lesão do nível cervical 4 (12 semanas tecido postinjury) foram cortadas e coradas com anticorpos contra PKC gamma (E). A CST no lado esquerdo da imagem é intacto e pode ser visto através da linha média abaulamento para o lado desnervado, presumivelmente devido à desintegração estrutural da dorsal ferido CST.