ניתוח של Tubular ממברנה רשתות בלב myocytes מאטרייה וחדרי לב
Özet
בmyocytes לב, מבני קרום צינורי ליצור רשתות תאיות. אנו מתארים מותאמים פרוטוקולים לבידוד i) של myocytes מלב העכבר כוללים בקרת איכות, ii) מכתים תא חי למיקרוסקופ פלואורסצנטי המדינה של-the-art, וiii) ניתוח תמונה ישירה לכמת את מורכבות רכיב והפלסטיות של קרום תאיים רשתות.
Abstract
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
Introduction
בתאי שריר משורטטים בריאים, מבני קרום צינורי עם אוריינטציות "רוחביים" (T-tubules) בניצב לציר התא העיקרי הם בשפע. כתוצאה מכך, T-tubules מתאפיינים כהרחבות מתמשכת של תאי השריר "לרוחב" עיקרי קרום פני השטח (sarcolemma), אשר עמוק לחדור cytosol לכיוון מרכז התא. התפקיד הפיזיולוגי של T-tubules רציף עם קרום פני השטח החיצוני הוא הצימוד החשמלי המהיר של תאים תאיים מרוחקים שהוקמו על ידי תחומים מגע אברון SER לאורך גדול יחסית לב תא שריר על ידי צימוד קרבה ננומטריים של L-סוג מופעל מתח Ca נפח 2 + ערוצים (Cav1.2) פנימה הנוכחי (אני Ca) הפעלת קולטן ryanodine הסמוך משחרר (RyR2) SER Ca 2 +. בmyocytes חדרית (VM), אנשי הקשר לא רציף קרום ("צמתים") בין תחומים SER junctional וT-tubules הם חשבו לשלוט אלפי nanodomains Ca 2 + שחרור תאיים הבודד בכל תא 1.
לכל תחום קשר נתון, חלקי קרום זה לצד זה כל אחד מT-אבובית וSER ההיקפי (junctional) הם כ 15 ננומטר קרוב זה לזה, ומכאן שהוגדר כnanodomain. וכך, subspaces cytoplasmic פרט הקטן ביותר הפרדה המאפשרת התנהגויות תא תאים אוטונומיים למחצה. כאשר פוטנציאל פעולה נכנסת מפעיל ערוצי Cav1.2 בT-tubules של מכונות וירטואליות, Ca קטן יחסית 2 + פנימה נוכחי יהיה במהירות להגדיל את ריכוז subspace Ca 2 + S [Ca 2 +] בnanodomain בגודל attoliter 1. בשלב בא, העלייה [Ca 2 +] S מפעילה Ca 2 + קולטנים ryanodine -gated (RyR2) בתוך קרבת ננומטר בצומת קרום SER זה לצד זה, ותהליך צימוד זה מתרחש לאורך כל הזוג חשמליnanodomains myocyte ד. RyR2s להתרחש אשכולות מרובים ערוצים צפופים כמו עם stoichiometry משוער של ערוץ Cav1.2 1 ל5-10 ערוצי RyR2 2. מאז SER-to-cytosol [Ca 2 +] שיפוע תלול מאוד (יחס 10 4: 1) וRyR2s לתפקד כגבוהות מוליכות Ca 2 + ערוצי שחרור באשכולות בשילוב פונקציונלי, תוצאות הפעלת RyR2 בCa גדול כמותית 2 + לשחרר נוכחי מתחומים T-אבובית יחד junctional SER הגדלת subspace המקומי S [Ca 2 +] ל100 מיקרומטר או גבוהים יותר בטווח של 1-2 3,4 האלפיות השני. זה התנהגות הגברה אות לב גם נקראת Ca 2 + מושרה שחרור Ca 2 + (CICR). יחדיו, T-tubules הם מבני קרום חיוניים שבמהירות להפעיל אותות שחרור Ca 2 + באמצעות אנשי קשר SER nanodomain junctional וCICR תא רחב במהלך עירור והתכווצות צימוד (EC).
בנוסף לT-tubules, אבובית הציריתשל (A-tubules) עם מקביל אורינטציה שונה באופן משמעותי לציר התא הראשי (אורך) תועד על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), confocal ומחקרי מיקרוסקופיה 2 פוטונים. למשל, סריג רציף תא רחב של-tubules בין myofibrils מחובר עם T-tubules ליד Z-קווי sarcomere הוצג על ידי קליעים נותבים תאיים וההדמיה EM פן ניסיונות קבועים מכונות וירטואליות 5 של. באמצעות מכתים והעמסת צמוד dextran תאי ולחיות הדמיה 2 פוטונים של עכברוש מכונות וירטואליות, רשת אבובית 3D רשתי מורכבת הייתה דמיינה בהיקף של ~ 60% T-tubules ו~-tubules 40% 6. מחקר זה לא רק הוביל להדמיית 3D של-tubules בשפע, אלא גם להבנה שחתכה להדמיה EM מוגבל מטבעו לניתוח של רשתות קרום מורכבות ודינמיות כמו המערכת רוחבית צירית אבובית (מידות). כתוצאה מכך, הדמיה תא חי confocal של קרומי מידות מוכתמות ישירות עם di-8-ANNEPS פותח. אם תא חירשתות מידות מנותחות שינוי פורייה, את המראה הרגיל של רכיבי T-אבובית בחלל קרוב Z-קווי sarcomere בא לידי הביטוי על ידי כוח ספקטרום ההרכב מאזור של אותות משורטטים 7. אסטרטגית ניתוח עקיפה זה נעשתה שימוש כדי לזהות שינויים אזוריים תא רחב בסדירות מרכיב מידות במודלים של מחלות 7. לדוגמא, בתיווך shRNA junctophilin-2 עקומות למטה נגרמו אי ספיקת לב והמחסור בחלבון המסוים איזופורם הביאו ארגון מחדש T-אבובית עם nanodomain Ca תפקוד לקוי של שחרור 2 + 8. לאחרונה הרחיבו את הניתוח של רשתות קרום מידות באמצעות גישות כמותיות ישירות ועוד יותר על ידי מיקרוסקופ superresolution התא החי של רכיבי מידות בודדים בעכבר המכונות הווירטואליות באמצעות דלדול פליטה מאולץ (STED) nanoscopy 9. רזולוציית תמונה ננומטריים אפשרה לניתוח ישיר של רכיבי מידות פרט קטנים יותר, אשר משוער הפצת 50:50 של רוחבילעומת אוריינטציות אבובית ציריות, כמותית המאשר שני מרכיבים בשפע עדיין בכיוון באופן דיפרנציאלי בודדים מידות בלבבות עכבר בריאים 9. אסטרטגיות אלה יהיו מתוארים נוספים בסעיף הפרוטוקול להלן.
בעוד התפקיד הפיזיולוגי של הרכיבים-אבובית השופעים בלב המבוגר נשאר מסתורי, מחקרי EM תעדו מבני קרום SER הקשורים-tubules מציע Ca אנדוגני 2 + nanodomains שחרור בפן ניסיונות ועכברוש מכונות וירטואליות 5,10. ניתוח Confocal של Cav1.2 וRyR2 מצא רמה גבוהה של colocalization בצמתים-אבובית 10. מאז ~ 20% מ2 + ניצוצות Ca ספונטניים בחולדת מכונות וירטואליות מקורו יחסית רחוקות מפסי Z-קו שבו T-tubules מתרחש בדרך כלל, טיעון אחד היה שnanodomains-אבובית קשורה אכן קיימת ומתפקד כ2 + אתרי שחרור Ca 11,12. מעניין, היווצרות T-אבובית וoc ההתבגרותבני כלאיים רק לאחר לידה, ומקביל לצמיחה של תאי לב, למשל, דרך נביטת invaginations sarcolemmal המבשר בP5 ולא בשלה מסועפים מכלולי רשת המידות בP10 בעכברים 13. נראה כי Junctophilin-2 הוא חשוב במיוחד עבור התבגרות רשת מידות לאחר לידה מאז shRNA לדפוק למטה מנע העיגון של קרומי T-אבובית לצומת SER מוביל לשחרור מושהה Ca 2 + וארגון מידות פתולוגיים בקנה אחד עם ארכיטקטורות-אבובית לא בשלה שלטו ב 13 מכונות וירטואליות. תצפיות אלה עשויות סופו של דבר להוביל להוכחה של הקונספט שT-tubules ליצור באמצעות תהליכי invagination הקרום ואילו-tubules עשוי מורף באמצעות מנגנונים תאיים נוספים או אפילו חלופיים 14.
אפיון של מידות שינויי קרום במחלות לב הפך אזור מחקר חשוב לשאלות pathophysiological. דיווחים ראשוניים במודל כלב של failu לב הנגרם על ידי קצבמחדש הראה הפסד של T-tubules ונוכחי Cav1.2 (אני Ca) 15. מודל חזיר של קרדיומיופתיה איסכמית הראה מופחת צפיפות T-אבובית ותיאום מופחת של Ca 2 + תאיים לשחרר 16. תוך שימוש במודל החולדה באופן ספונטני עם יתר לחץ דם (SHR) של אי ספיקת לב, אובדן של T-tubules היה קשור בצימוד nanodomain מופחת של Cav1.2 וRyR2 על ידי המנגנון המוצע של "RyR2 orphaning" 7. הפסד של T-tubules גם הוכח במכונות וירטואליות אנושיות מדגימות קרדיומיופתיה איסכמית, מורחבות, וhypertrophic 17. יתר על כן, עלייה ב- tubules דווחה בסעיפי רקמות של קרדיומיופתיה מורחבת האנושית 18. בעקבות אוטם שריר לב, שהראינו מנגנון ההפרש של ארגון מחדש מידות בעכבר מכונות וירטואליות עם ירידה משמעותית של T-tubules בניגוד לעליות של רכיבים-אבובית 9. חשוב לציין, לעומת זאת קרום מקומי השתפרו מושגים באמצעות superre תא החימיקרוסקופיה STED פתרון אפשרה ניתוח מרכיבים כמותיים מפורט מדידות ישירות, אשר הראו ריבוי משמעותי של-tubules עם עליות הכוללות של אורך רשת מידות ומסתעפים מורכבות 9. יתר על כן, הם הראו שאימון גופני יכול להפוך שיפוץ T-אבובית בחולדות לאחר אוטם שריר לב 19 וכי טיפול resynchronization לב עלול להוביל להיפוך שיפוץ של T-tubules בכלבים עם tachypacing המושרה אי ספיקת לב פרוזדורים 20. יחדיו, מחקרים הן באדם חולה וחית מכונות וירטואליות כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות לטעון נהנים מהנהלים בידוד תא באיכות גבוהה ובאסטרטגיות ניתוח כמותי מפורטות כפי שתוארו בפרוטוקול ותוצאות סעיפים שלהלן.
יתר על כן, כפי שהודגם לאחרונה על ידי משטח לרוחב לעומת סחר בקרום מידות של ערוץ KATP isoforms 21, חשוב לשקול מ פרוזדוריםyocytes (AMS) כביולוגי מובחן, כמו גם מודל תא לב השוואתי לעומת מכונות וירטואליות. T-tubules תועדו לאחרונה בכבשים ואנושי 22 AMS. ראיות הנוכחיות מצביעות על כך שכמה T-tubules קיימים בתאים בבוקר ובדרך כלל ביונקים גדולים יותר כמו כבשים ובני אדם, אך לא במכרסמים קטנים 23. בניגוד למכונות וירטואליות, באדמיניסטרטיבים שחרור תאיים Ca 2 + מופיע להתרחש מpropagating פני תא על ידי דיפוזיה לכיוון מרכז התא וכתוצאה מכך Ca מרחב ובזמן מסומן 2 + הדרגתיים 23. במסגרת זו נראה חשוב להבהיר מנגנונים של Ca 2 + איתות תאית חוסר יציבות לצורות מחלה נפוצות כגון פרפור פרוזדורי 24. לסיכום, שני בידוד AM וVM התא וכל ללב בריא וחולה בדרך מועסק פרוטוקולים. רק אם בידוד תא נעשה כראוי כמו להישפט על ידי תיעוד מיקרוסקופי של איכות תא מספיק, דגימות בבוקר וVM צריכה להיות carried קדימה לניתוח מידות כמותי. בהתאם לכך, בסעיפי הפרוטוקול הבאים תלויים באופן קריטי בתא באיכות גבוהה מבודד מעכבר או מינים אחרים ואחריו מיקרוסקופיה תא החי לנתח קרומי מידות ללא פגע. כפי שציין בעבר, אפיון של ממברנות מידות הוא תחום מחקר מאתגר עם נטייה לחפצי קיבעון והכנת 6, שינויי קרום בשל שינויים האוסמוטי, ומגבלות רזולוציה של מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית 9. נציין, כי פרוטוקולי המדינה של-the-art האחרונים לבידודה של אדמיניסטרטיבים אנושיים הדמיה Ca 2 + ותיקון מהדק ושל עכברוש מכונות וירטואליות לתרבית תאים כבר פורסמו בעבר בכתב עת זה 25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות myocytes לב היה מבודד ולמד במשך עשרות שנות 32, הסקירה האחרונה הגיעה למסקנה כי בידודי תא myocyte באיכות גבוהה בקנה אחד יישארו מאתגרים 27. זה משקף פרוטוקולים מורכבים יחסית לבידודה של myocytes לב העיקרי כלפי מול חוסר גישות סטנדרטיים נפוצות, מטה משותף, ותיעוד באיכות תא שקוף. פרוטוקולי בידוד תא בדרך כלל מותאמים אישית על ידי קבוצות בודדות, לייצר תוצאות משתנה של תא מבודד, תלויים בהגדרות בודדות דגם (לדוגמא, מין, גיל, מחלות לב coexisting), והם בדרך כלל מותאמים לתנאי ניסוי מסוימים. בהקשר של המידות כמותי מחקרי קרום ופרוטוקולים שהוצגו כאן, ברמה מהותית של הערכת איכות ותיעוד נוגע למיקרוסקופיה confocal או superresolution של מבני קרום תא בודדים נוטים לשינויים תלויים חילוף חומרים ופרוטוקול בידוד, שניהםבבוקר או VM. חשוב לציין, גם אם תשואות גבוהות של בידודי תא מציעות myocytes שלם בריא, חוקרים צריכים לתעד וביקורתי לשפוט כל תא בודד בזהירות נגד קריטריונים מורפולוגיים של פני השטח ושלמות קרום מידות לעומת נזק שאינו ספציפי בשל נהלי בידוד לעומת שינויים ספציפיים בשל סוגים שונים של התערבויות בהשוואה לשליטה בתנאים. משתנה חשוב בבידוד תא לב הוא הפעילות הספציפית של הרבה collagenase נתון. כדי לבחור הרבה חדש של collagenase, הפעילות האנזימטית של כמה דגימות collagenase צריכה להיבדק אחד נגד השני על ידי הערכת תשואת myocyte לב ואיכות, ובהתאם להוראות יצרן. באופן אידיאלי, הרבה חדש של collagenase מזוהה עם פעילות collagenase דומה להרבה השתמש בהצלחה קודמת (להערכה מורחבת של פעילויות אנזים אפשריות מתייחס ל" כלי הבחירה הרבה collagenase "בטבלת החומרים ושיטות). TAken יחד, גישות כמותיות של הדמיה קרום מידות תלויות באופן קריטי על איכות בידוד תא ו, להיפך, בידודי תא לב מובילים לנזק קרום נוקב כפי שתועד על ידי מיקרוסקופ מידות צריכים לעורר ביקורת ותיקון קריטיות של נהלי הבידוד. מאז איכות בידוד התא ויזואליזציה קרום המידות וכימות קשור באופן מהותי, את הפרוטוקולים שנדונו במאמר זה לכסות את כל ההיבטים המרכזיים כאסטרטגיה מתמשכת.
אתגר נוסף ובעיה נפוצה של מחקרי לב, נזק לתאים ו / או אובדן תא להתרחש עקב התערבות מטבולית להתפשר למשל, בעקבות אוטם שריר לב 9, עדיין צריכים להישפט על פי דוגמא נזק שלא במתכוון פוטנציאלית, בעקבות תסחיף אוויר מעיניו במהלך בידוד תא. בידוד של myocytes לב מלב חולה עלול להוביל ל, אובדן תא משמעותי נוסף וירידה בתשואות תא. לכן, comparison של המספר הכולל של תאים שלמים מבודדים בין שליטה ולבבות חולים יכול להיות משמעותי אם בידוד תא וספירה מיושמים באופן עקבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. כתוצאה מכך, זה הוא קריטי כדי לשפוט שלמות תא דרך קבוצת ביקורת מתאימה, המבטאת את איכות בידוד תא myocyte הטובה ביותר האפשרי. חשוב לציין, באיכות תא בודדת ומיקרוסקופיה תא החי של בריא לעומת חולה לעומת myocytes נפגעו בטעות על ידי הליך הבידוד עשויים להשפיע על הניתוח של רשתות קרום מידות באופן משמעותי. הפרוטוקולים שהוצגו כאן ולכן מדגישים את השלמות ויציבות של רכיבי קרום פיסיולוגיים במהלך בידוד תא ומיקרוסקופיה תא החי של קרומים. כל זרימת העבודה נועדה כאסטרטגיה מתמשכת כדי להשיג ולשמר את מרכיבי קרום מידות ללא פגע ואילו בניכוי תאים פגומים, שכן אלה יציגו חפצי קרום תלויים בידוד כמו צינוריות קרום שיבשו, membranblebs דואר, ורשתות מידות שינו בטעות בתנאי בקרה ולהתפשר ניתוח כמותי נוספת. להיפך, את אותן האסטרטגיות חיוניות למחקרי התערבות עם הפוטנציאל לשבש קרומי מידות, אשר תלוי באופן קריטי על בקרות השוואה משמעותיות בין אמיתי בריא לעומת תאים חולים אמיתיים עם מידות שינויי קרום.
בנוסף, אנו פונים נהלים כדי להשיג את הבידוד מבחינה טכנית הרבה יותר מאתגר של תאי AM. למרות התקדמות ופרוטוקולים משופרים, חשוב להדגיש שזה לא טריוויאלי לשחזר בידודי תא באיכות גבוהה של מכונות וירטואליות ועוד פחות אמינה לחובבנים. זאת בשל התשואה הנמוכה הכוללת של תאי AM שבו אפילו שגיאות או שינויים קטנים בבידוד תא עלולות להוביל להשלמת כישלון של בידוד תא AM, ואילו מידה מתונה של נזק לתאי VM עלולה להיות פחות נראית לעין בהשעית תא עקב גבוה יחסית תא מספרי השוואה לAM. מאחר ותאי AM עלולים להפוך גurved לאחר בידוד, ניתוח באמצעות מספר ROIs יכול להיות יתרון כפי שתואר תחת שלב 4.3. בעקבות הליך מפורט של צעדי בידוד תא, אנו מספקים פרוטוקול מכתים ישיר נפרד קרום וconfocal או הדמיה superresolution STED של רשתות מידות הן למכונות וירטואליות וחובבנים. פרוטוקולים אלה מאפשרים גם ניתוח כמותי ובידול של רכיבים נבחרים של קרומי מידות באמצעות פרמטרים שנקבעו בעבר. בהשוואה למכונות וירטואליות, ארגון 3D והתנהגויות פונקציונליות של רשת מידות פרוזדורים באדמיניסטרטיבים כרגע פחות מובן.
הנהלים לממברנות מידות תמונה בתאים חיים (שלבים 3.1-3.7) פותחו עם confocal המסחרי (טבלה של חומרים / ציוד) ומיקרוסקופים הקרינה STED מחוייט 9. כדי לייעל את הגדרות מיקרוסקופ לדור תמונת ניאון וניתוח מידות כמותי, את הנקודות הבאות הן בעלי חשיבות כללית:
- מטרה </strאונג>
על מנת לפתור את הפרטים קטנים של מבני קרום מידות, באופן אמפירי לבדוק בו מטרה מספקת את איכות התמונה הגבוהה ביותר, תוך התמקדות כמה מיקרומטר עמוק בתא. מיקרוסקופי confocal מסוימים עשויים לתפקד טובים יותר עם מטרות מים או גליצרול, בניגוד למטרת נפט NA 63X 1.4 משמשת כאן. יעדים עם ההגדלה 100x משמשים למיקרוסקופיה STED superresolution, נסחר מעל שדה קטן יותר של תצוגה עבור רזולוציה ננומטריים 34. - עירור ורווח
ההגדרות אופטימליות של כוח העירור ורווח גלאי תלוי בדרך מיקרוסקופ האור, ביצועי לייזר, ומאפייני מדגם. באופן אידיאלי, כוח הלייזר ורווח מותאמים לנצל את הטווח המלא של הגלאי, עדיין למנוע הרוויה תמונה. חבילות תוכנת מיקרוסקופיה מסחריות בדרך כלל מספקות שולחנות בדיקה שלדמיין את הגבול התחתון והעליון של הטווח הדינמי. יתר על כן, על מנת למזער הלבנת צבע להעסיק l הנמוך ביותר האפשריכוח aser שעדיין מספק פרטי קרום מידות מבניים מספיק. כמו כן, כוח העירור צריך להיות נמוך מספיק כדי למנוע נזק מצטבר תמונה מובילה לcontractures myocyte ומוות. - גודל פיקסל
השתמש בגודל פיקסל תואם דגימת נייקוויסט, כמחצית מהרזולוציה שהושגה עם ההגדרות שניתנו. ההדמיה confocal גודל פיקסל של 100 ננומטר x 100 ננומטר הוא תואם, אשר יהיו גם להגביל את ההלבנה. למיקרוסקופיה superresolution גדלי פיקסל קטנים יותר באופן משמעותי נמצאים בשימוש לדוגמא, 20 ננומטר x 20 ננומטר לSTED מיקרוסקופיה 9. - Dwell זמן
מיקרוסקופי confocal לספק פונקצית מיצוע. באופן כללי, שימוש בזמן להתעכב פיקסל הקצר ביותר האפשרי, כדי למנוע הלבנה בשילוב עם למשל מיצוע אות, ≥ 8 כדי לשפר את רעש יחס אות לממוצע אונליין. - לתעד את הגדרות מיקרוסקופית מיושם באמצעות Meta-data
ברגע שההגדרות איךפרטי תמונה של מבני קרום מידות היו מותאמים במיקרוסקופ confocal מסוים, בטוחים ו / או לתעד את ההגדרות (meta-data פרוטוקול). לרכוש את כל התמונות בתוך קבוצה (או בין) (ים) של תאים עם אותה המטרה, כוח העירור, רווח, גודל פיקסל, פיקסל להתעכב זמן, ותפקוד בממוצע. תנאי הדמיה שווים לאפשר השוואה ישירה ולכמת בתוך קבוצה (או בין) (ים) של תאים. - להנחיות כלליות ופרטים נוספים על עקרונות ויישומים של מיקרוסקופיה confocal מתייחס לHandbook of Biological Confocal מיקרוסקופית (פולי JB, מהדורת 3 rd, 2006 פרינגר מדעי + עסקי מדיה, LLC).
בניגוד לאסטרטגיות הישירות הניתוח שהוצגו כאן, הפרסומים קודמים המתארים את קרומי מידות ושינויי מחלה קשורה, השתמש קריאות כוללת אזוריות של צפיפות T-אבובית כאסטרטגיה כמותית 16,17, או אסטרטגיות אזוריות עקיפות המבוססת על transf פורייהניתוח ormation של אותות קרום מפוספסים על מנת להעריך סדירות מרכיב T-אבובית 7. בניגוד לכך, גישות כמותיות שתוארו כאן קשורות ישירות לרכיבי מידות אישיים ולספק מספר פרמטרים נוספים הכוללים מאפייני רשת קרום ורכיבים ספציפיים כמו אחוז-tubules. יתר על כן, צפיפות רשת מידות ניתן לכמת כאורך המנורמל של השלד שחולץ כל לאזור החזר על השקעה. מספר צמתים משולשים של שלוש בודד, ניתן להשתמש ברכיבי אבובית מחוברים באופן רציף כמדד למורכבות ההסתעפות של רשת קרום המידות. נציין, כי כל ניתוח של רכיבי מידות הקטנים ביותר תלוי בנהלים מכתים. מניסיוננו, 800 μl של פתרון di-8-ANEPPS 50 מיקרומטר יש בם כדי להכתים רשתות מידות מלאה בתא גלולה המכילים 50,000 תאי VM 9. עם זאת, אם התא גלולה מכיל מספר נמוך יותר של myocytes לב, אם גלאי הקרינה רבי עוצמה זמינים, ואם ההדמיה confocal של ההפצה ברשת מידות הכללית ולא פרטי הקרום הקטנים ביותר ושינויים הכמותיים הם עניין, ריכוזי צבע נמוכים יותר ניתן להשתמש על בסיס בדיקות אמפיריות. לבסוף, תוכנת מקרו שנכתב לניתוח שתואר יכול לשמש כדי להפוך את צעדי עיבוד תמונה כדי להקל על ניתוח של מערכי נתונים גדולים יותר, שהוא שימושי במיוחד להשוואה בין קבוצות שונות טיפול (למשל, תרופות), סוגי תאים (לדוגמא, הנני מול VM ), והתערבויות pathophysiological (למשל, העמדת פנים מול אוטם שריר לב).
לניתוח תמונה של רשתות מידות, הרצף של צעדים עיקריים הבא מוחל: 1) כדור מתגלגל רקע חיסור (4.5.1) כדי להסיר וריאציות מרחבית בעוצמת רקע; 2) שיפור לעומת מקומי (4.5.2).; 3) החלקת תמונה (4.5.3); 4) התמזגות האזור סטטיסטי (4.5.4); 5) המגדיר אתסף של binarization תמונה (4.5.6); ו6) חישוב נתוני השלד (4.5.8). צעד קריטי במהלך skeletonization של תמונות מידות ניאון הוא binarization התמונה שמוצגת באיור 6. צעדי thresholding הקשורים סופו של דבר להגדיר אילו מבני קרום אמיתיים מתגלים לייצג את רכיבי מידות הבסיסיים לעומת מבנים שעלולים להיות כוזבים זוהו על ידי שגיאה מרעשי רקע. זיהוי של הסף הנכון לניתוח תמונה בינארי צריך להתכתב עם המידות האמיתיות מבני קרום, אשר תלוי ביחס גבוה מספיק אות לרעש (SNR) עבור כל גישות מיקרוסקופיה confocal וsuperresolution. לכן, איכות תמונה מספקת צריכה להיות ראשונה שהוקמה בשילוב לאחר מכן עם שיפוט ביקורתי של איכות תא בודדת כולל תיעוד על ידי תמונות שדה בהירות כפי שתואר. אפשרויות חלופיות להתאמת פרוטוקול פילוח תמונה עבור פלט נתון מיקרוסקופ נתונים ו / או Physשאלות iological כוללות deconvolution תמונה ונהלי thresholding אחרים כמו "אוטסו" או "Iso-נתונים" זמין כתוספי ImageJ. בלי קשר להליך הפילוח הסופי, אנו רואים את ההשוואה בין הנתונים שחולצו וגלם על ידי שכבת תמונת צעד בקרת איכות חובה. לסיכום, יושרה מורפולוגיים וקרום של myocytes המבודד הבודד, מכתים מספק של קרומי מידות תאיים, אופטימיזציה פרמטר עבור דימות פלואורסצנטי, ושליטה כיסוי של נתוני שלד חילוץ תהיה כולם תורמות לאיכות תמונות מידות ניאון ותוצאות כמותיות.
אם מינים גדולים יותר מעכבר המשמשים לבידוד תא, הפרוטוקולים ניתן להתאים בקלות על פי צורך. עבור המינים הגדולים הבאים, ניתן cannulated לב חולדה עם צינורית בוטה 14 G (קוטר חיצוני 2.1 מ"מ) וperfused ב8 מ"ל / דקה. באופן משמעותי את לב מבוגר או חולה עשוי לדרוש גדלי צינורית גדולים עוד יותר. בגןRAL, זלוף לב יכול להתבצע גם על ידי דוגמא לחץ קבועה, תוך שימוש בעמודת מים גבוהים מ 1 בין מאגר ואב עורקים או על ידי זרם בלתי פוסק באמצעות משאבת peristaltic. בידוד תא מלב מכרסם קטן כמו עכברים וחולדות זרם בלתי פוסק עשוי להיות יתרון מאז עיכול collagenase סופו של דבר לשבש כלי התנגדות כליליים מובילים לשיעורי זלוף מוגזמים מהמיטות כלי דולפות שיהיה בשליטה במידה מסוימת על ידי זרימת פרוטוקולים קבועים. בניגוד לכך, זלוף לחץ הקבוע הוא יתרון אם ניטור של קצב הזרימה וcannulation הנכון הוא בראש סדר עדיפויות, וזה יתרון עבור דגמי התערבות עם התנהגויות התנגדות כלי דם שינה כמו גם להכשרה של נהלי בידוד תא.
כפי שתואר לעיל, איכות תא מספיקה היא מאוד חשובה עבור מחקרים כמותיים של מערכות קרום אנדוגני. עם זאת, במהלך עיכול זלוף וcollagenase לב גורמים רבים יכולים CRitically להשפיע על איכות בידוד התא, שאף פעם לא צריך לזלזל באופטימיזציה פרוטוקול או פתרון בעיות 27. בפרט, הפעילות של הרבה collagenase נתון יש לקבוע עבור הרקמות הספציפיות של עניין למשל, אטריה או חדרי לב לפני ביצוע המחקרים בתום לב הניסיוני לשם קביעת תנאי בידוד להישמר בכל שאר המחקר. יתר על כן, איכות מים, רמת חומציות, טמפרטורה, אופטימיזציה והניקוי של תוכנית ההתקנה של זלוף תהיה למזער את הסיכון לניזק שלא במתכוון ממזהמים ותסחיפים, וגורמים פוטנציאליים נוספים צריכים להיות במעקב לשם קביעת תנאים ההומיאוסטטית אופטימליים במהלך בידוד תא. BDM (2,3-butanedione-monoxime) מעכב הפיך של גשרים צולבים ATPase שרירן משמש בדרך כלל במהלך נתיחה ועיכול רקמה כדי לקיים הרפיה שריר לב, דבר המגדילה את התשואה של בידודי תא. עם זאת, חוקרים צריכים t o להיות מודע לכך שBDM יכול להפעיל פעילויות phosphatase שאינם ספציפיות שמובילות להשפעות מחוץ היעד למשל, עיכוב של זרמי 2 + חילופי Na + / Ca בתנאים מסוימים 33. עבור חלק מניסויים שזה עשוי להיות יתרון להחליף BDM ידי blebbistatin כפתרון cardioplegic, מעכב עם זיקה חזקה לשרירן בריכוזים מייקרו שהוא, לעומת זאת, רעיל ויקר יחסית ועשוי להיות השפעות מחוץ יעד אחרות. שריר לב בריא נח לא צריך להראות התכווצויות כל בהעדר גירוי החשמלי ותאים מסוג זה צריך להיות מחוץ ניתוח נוסף. מצד השני, התכווצות לב myocyte ורגיעה בתגובה לגירוי חשמלי בCa 2 + ריכוזים תאיים פיסיולוגיים יכול לשמש כדי להקים נורמלי התנהגות התכווצות כאמצעי נוסף להערכת איכות פונקציונלית תא ו / או התנהגות חריגה במחלת לב לעומת שליטה בריאה תאים.
<p class="Jove_content"> לסיכום, הפרוטוקולים לבידוד תא בודד וניתוח תמונת כמותית המתואר כאן יושמו בהצלחה למיקרוסקופיה confocal וsuperresolution של רשת קרום המידות ב9 VM והנני תאי 21 כמו גם לניתוח כמותי של רשתות microtubule ב myocytes קבוע לב (מידע לא מוצג). של פרוטוקולי יישומים אלה ובעתיד עשוי לפתוח כיווני מחקר עבור מגוון רחב של שאלות ניסיוניות כגון האפיון של ממברנות מידות בשלבי התפתחותיים שונים או הניתוח של מבנים חלבוניים או אברון קרום קשור שקשר עם רשת המידות להפעיל מקומיים, איתות תחום מאוד ספציפי פונקציות בתאים בבוקר וVM.Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Materials
| Chemicals and enzymes | |||
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
| Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
| Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
| Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
| Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
| HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
| Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
| KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
| KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
| Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
| MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
| MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
| Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
| NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
| Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
| Langendorff perfusion setup | |||
| Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
| Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
| Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
| Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
| Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
| Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
| Instruments | |||
| 42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
| Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
| Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
| Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
| LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
| Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
| POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
| Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
| Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
| Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
| Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
| Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
| Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |
Referanslar
- Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity. J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).
- Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. Intracellular calcium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).
- Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes. Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).
- Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart. Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).
- Sperelakis, N., Rubio, R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).
- Soeller, C., Cannell, M. B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques. Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).
- Song, L. S., et al. et al. ryanodine receptors in the failing heart. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).
- Oort, R. J., et al. Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice. Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).
- Wagner, E., et al. Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction. Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).
- Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum. Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).
- Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells. J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).
- Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells. J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).
- Reynolds, J. O., et al. Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development. Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).
- Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms. J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).
- He, J., et al. Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).
- Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).
- Lyon, A. R., et al. Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).
- Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart. PLoS One. 6 (3), e17901 (2011).
- Kemi, O. J., et al. The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts. J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).
- Sachse, F. B., et al. Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy. Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).
- Arakel, E. C., et al. Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes. J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).
- Richards, M. A., et al. Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).
- Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias. Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).
- Greiser, M., Schotten, U. Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation. J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. (31), (2009).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji, an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Liu, Z. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. Superresolution microscopy in heart – cardiac nanoscopy. J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).
