비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회는 설명 된 모든 생체 작업을 승인합니다. 시료 채취는 환자의 동의하에 수행 의​​학의 예일 대학의 인간 조사위원회에 의해 승인되었습니다. 인간 난소 암 세포의 1. 준비 준비하기 전에 세포는 아래에 설명 된 자궁 내 주입에 필요한 모든 재료가 준비하고 쉽게 접근 할 수 있는지 확인하십시오. 이는 준비되는 즉시 세포 현탁액을 주입한다. 문화에 형광 표지 된 암세포를 성장. 우리는 우리가 이전에 같은 발암, 내성에 종양 수리 14-19 높은 용량으로 stemness 속성을 항구 증명 인간의 CD44 + /에서 MyD88 + 상피 성 난소 암 세포의 F2 세대를 사용합니다. 이러한 세포가 안정적 mCherry 형광을 표현하기 위해 생성되었다 (F2-mCherry,도. 1) 렌티 폴리에틸렌 이민으로부터 제조 사용 하(PEI) 프로토콜 (20, 21). 주사의 날, 트립신으로 세포를 수확하고 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 한 번 씻는다. 세포 수를 결정하고 3 × 10 6 세포 / 적절한 성장 미디어 50 μL에서 세포를 일시 중지합니다. 난소 암 세포를 위해 우리는 10 % FBS와 RPMI (160)를 사용합니다. 주입 할 준비가 될 때까지 배양기에서 세포를 유지하지만 15 분 이상을 유지하지 않습니다. 이것은 하나의 마우스 주입을위한 충분하다. 를 누드 마우스에서 인간 난소 암 세포의 2. 자궁 내 주입 다음 절차는 두 번째 사람의 도움을 필요로합니다. 이 생존 수술을하기 때문에 또한, 무균 수술 도구를 사용합니다. 이 생존 수술 절차는 약 10 ~ 15 분 소요됩니다. 2 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 7- 8 주령를 누드 마우스는 일반적으로 사용됩니다. 동물이 COMPLET 있는지 확인엘리 손가락이나 집게를 사용하여 발 패드를 집어 anesthesized. 동물은 수술을 시작하기 전에 고통에 완전히 응답하지해야합니다. 멀리 조사에서 머리와 멸균 거즈 패드에 마취 된 마우스 복부 측면을 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해면 – 팁 어플리케이터 눈에 연고를 적용합니다. 즉시 이소 플루 란 기화기 (그림. 2A)에 연결된 코 콘 시스템에 머리를 삽입합니다. 이 수술 전반에 걸쳐 마취를 제공합니다. 후 수술 부위를 통해 무균 수술 드레이프를 배치 왼쪽 소독 (또는 오른쪽) 요오드 다음에 복부 사용하여 알코올 패드 (그림. 2B)의 측면. 사용 무균 수술 가위와 집게 마우스 (그림. 2C)의 왼쪽 하단 사분면에 1-2cm의 피부 절개를합니다. 근육을 들어 올린 후 복막에 도달하기 위해 절개를합니다. <리> 복강을 노출 근을 해부하다. 찾아 왼쪽 자궁 뿔 (그림. 2D)를 식별합니다. 멸균 지혈을 사용하여, 호른 (도. 2E) 모두 전방 및 후방 측면 클램프. 오른쪽 나팔관 아래 전방 클램프과 오른쪽 자궁 경부 위의 후방 클램프를 놓습니다. 두 번째 사람은 세포 현탁액을 주입하게한다. 혼 (그림. 2 층)에 수직으로 45 ° 각도에서 세포를 포함하는 바늘을 놓습니다. 아주 천천히 자궁 뿔의 루멘 내로 세포 현탁액 50㎕의 주입. 바늘을 제거하고 전방 클램프를 놓습니다. 후방 클램프를 해제하고 복강에서 자궁 경적을 교체합니다. 합성 흡수성 봉합사를 이용하여 복막을 닫고 조직 접착제를 사용하여 피부를 닫습니다. 코 콘에서 마우스를 제거하고 새장에 다시 배치합니다. 필요한 경우, 클레아 있도록 침구 변경수술 후 N 케이지. 모든 동물은 무인 떠나기 전에 깨어 있고 활성화되어 있는지 확인하십시오. 최초의 48 시간의 수술 후 물을 마시는 0.11 ㎎ / ㎖에서 이부 프로 펜을 제공합니다. 그 후, 일반 식수로 교체. 주 : 무 흉선 누드 마우스를 사용하고, 피부 대신 봉합 조직 접착제를 사용하여 폐쇄되는 경우 수술 후 마우스를 분리하는 필요가 없다는. SCID 마우스는 더 공격적 분리해야 할 수 있습니다. 밀접 인해 아물지 않은 상처로 감염 가능성에 대한 절개의 사이트를 모니터링 할 수 있습니다. 라이브 생체 이미징에 의한 초기 단계의 복강 내 난소 암의 3 검출 생체 내 이미징에서 라이브로 복강 내 IP 질환의 존재를 확인합니다. 다 모드의 동물 회전 시스템 (MARS)은이 프로토콜에서 사용된다. MI 소프트웨어 내에서 MARS 캡처 소프트웨어에 액세스 할 수 있습니다. 이 모듈 제공영상 시스템의 캡처 및 분석 기능을 활용하면서 화성의 조정 컨트롤 설정을 캡처합니다. 단계 3.4 회전 프로토콜을 개발하기 전에 단일 뷰 영상을 사용하여 각 양상에 대한 개별 캡처 설정을 최적화합니다. 입력 값 캡처를 소정. 550 nm의, EM : 600 nm의 필터 캡처 설정 형광 캡처를 들어, 10 초 노출, 2 × 2 비닝 (binning)을 사용하여, 2.8, FOV 120mm, 예를 F-중지합니다. X 선 촬영의 경우, 10 초 노출을 사용, 2 × 2 비닝 (binning)은, 2.8, FOV 120mm, 35 KVP, 0.4 mm 알루미늄 필터 캡처 설정을 F는-중지합니다. 개별 세션 파일과 같은 단계 3.2의 매개 변수를 저장합니다. 시스템 인터페이스 획득 창에서 작성 / 편집 프로토콜 버튼을 선택하여 회전 시퀀스 프로토콜을 만듭니다. 이전에 저장 한 형광 세션 파일을 선택하고 1 단계로 저장합니다. 다음, 해당 X-Ray 세션 파일을 선택하고 2 단계로 저장합니다. 1 단계 선택으로 설정 회전을 사용전에 이미지 캡처 팝업 메뉴에서 시리즈는 기능의 원활한 시각화하기 위해 원하는 시작 각도, 범위 및 증분을 설정합니다. 특정 값은 -180 °의 시작 각도, 375도 범위, 15 도의 증가를 포함한다. 프로토콜을 저장하고 MARS를 초기화하고 각 단위의 각각에 대응 스텝 모터의 위치를 매핑 완료 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어 프로토콜에 의해 사용될 특정 회전 각도를 가진 동물 지지체에 위치 특정 동물에 대해 복부, 지느러미와 측면도를 정렬 후술하는 바와 같이, 최종 교정을 수행한다. 2 L / 분의 유량으로 공기 및 의료 2 % 이소 플루 란의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취. 회전 장치 탭을 불러 획득 메뉴 내에서 미리보기 버튼을 선택하여 정렬을 시작합니다. 다중 파장 또는 X-RA보다는 반사광 양상을 사용Y 양식이 과정을 촉진한다. 로드 마우스 옵션을 선택하고 위치 메뉴의 시리즈를 통해 진행합니다. 접을 수있는 노즈콘의 진공관 끝이 원추형 두부 홈에 있는지 확인하고, 노즈콘에 머리와 쉬운 방향으로 마우스를 놓습니다. 아래로 향하게 동물의 복부 측면과 0도 위치에 교정을 시작한다. 이 미리보기 창 중앙에 나타나도록 동물의 위치를​​ 회전 시스템에서 두 개의 노브를 사용. 90, 90, 및 180도 위치를하고 완료를 클릭합니다 – -180를 입력하라는 메시지로,이 ​​과정을 반복합니다. 메인 획득 창에서 프로토콜 실행 단추를 클릭하여 이전에 저장 한 프로토콜을 실행합니다. 프로토콜의 실행 중에, 현재 캡처, 노출 시간, 및 전반적인 프로토콜 단계에 실시간 상태 업데이트를 제공하는 상태 윈도우를 관찰한다. 를 사용하여 동영상 형식으로 개별 이미지를 조립회전 소프트웨어. 밝기 / 대비, 투명도를 조정하고, 형광 신호의 표시 색을 설정하려면 디스플레이 컨트롤을 사용합니다. 프리젠 테이션의 *의 .avi 파일 형식으로 이미지의 마지막 순서를 보냅니다. 1 차 및 2 차 라운드 화학 요법 4. 관리 MARS에 의해 IP 종양이 검출, 표준 2 차원 측위를 사용하여 관심 (ROI)의 초기 종양 부담 영역을 결정합니다. 이것은 초기 ROI가 결정되면, 12 ㎎ / kg 파클리탁셀 (IP)의 4 투여 3 일마다 관리 섹션 5에서 후술하는 바와 같이 촬상 시스템에 끼워 투명 동물 트레이상에서 수행된다. 파클리탁셀은 차량으로 cremaphor와 준비-갈 제제에 호 스피라 사에서 얻을 수있다. 우리는 이전에이 치료법은 비히클 대조군에 비해 이종 이식 모델에 대한 상당한 항 종양 활성을 가지고 있음을 증명하고 검출 t의 완전한 박멸을 유도umor 부담 20. 처리 (20)를 종료 한 후 그러나, 질병의 특성, IP 종양 며칠 재발. 표준 2 차원 측위를 사용하여 3 일마다 이미징에 의한 치료에 대한 반응을 모니터링합니다. 파클리탁셀의 제 투여 후 (초기 ROI 50 % 증가까지 완전 반응 (ROI 2,000 미만), 부분 반응 (단계 4.1, 안정한 질환에서 얻은 초기 ROI에서 최대 35 % 감소를 갖는 것으로 생쥐 분류 ), 또는 관찰 된 형광 신호에 기초하여 처리 (초기 ROI에서보다 50 % 증가)와 함께 진행. 완전 반응과 쥐의 경우, 3 일마다 이미징에 의해 재발을 모니터링 할 수 있습니다. 재발 (단계 4.1에서 투자 수익 (ROI)을 최초 투자 수익 (ROI)을 =) 관찰되면 4.1에 설명 된대로 파클리탁셀의 두 번째 라운드를 다시 시작합니다. 일부 질환, 안정 병변, 또는 치료를 진행하는 사람들과 쥐에서 3 일 제 4 회 투여 후 파클리탁셀의 두 번째 라운드를 다시 시작파클리탁셀의. 마찬가지로, 영상이 3 일. 표준 2 차원 측위를 사용하여 치료 5. ​​모니터링 응답 생쥐를 마취하는 2 L / 분의 유속으로 의료 공기 및 2 % 이소 플루 란의 혼합물을 사용하여 묘화 될. 영상 실 (그림. 3) 내에서 투명 동물 트레이에 개별 nosecones에서 마취 된 쥐의 머리를 놓습니다. 입력 형광을위한 소정의 노출 매개 변수 (10 초 노출, 2 × 2 비닝 (binning), FOV 120mm, 전 2.8 F 스톱 : EM 550 nm의 600 nm의), 2 × 2 비닝 (binning) 및 X 선 (20 초 노출, 2.8, FOV 120mm, 35 KVP, 0.4 mm 알루미늄 필터) F-중지합니다. 순서대로 두 이미지를 캡처에 노출 클릭합니다. 육안 검사 및 관심 분석의 지역의 브루 커 MI 소프트웨어의 이미지를 엽니 다. 6. 이미지 오버레이 및 분석 보에 유효한 비교를 제공하기 위해,모든 전경 및 배경 이미지와 유사하게 시간 코스 이미지 시퀀스 프로세스의 일 시각 및 정량 분석​​. 소프트웨어에서 전경 이미지 (즉, 형광)과 배경 영상을 모두 열고 상단 (그림. 4A)에서 창 메뉴에서 타일 기능을 선택합니다. 포 그라운드 이미지를 처리​​하는 단계; 상단 바 (그림. 4A, 빨간색 화살표)에 이미지 디스플레이 탭을 열고 각각 260과 5000에 최소 / 최대 값을 설정합니다 (그림. 4A, 파란색 화살표) 참고 : 이미지 설정 범위 이미지 캡처 형광 신호 강도에 따라 공부하고 연구 다르다. 이미지는 종양의 질량을 보여, 아직 동물의자가 형광의 배경을 표시하지 않습니다 최소 / 최대와 대조해야한다. 왼쪽에있는 탐색 패널 (그림. 4B, 빨간색 화살표)에서 다음 오픈 자동 ROI를 탭하고 메뉴에서 새로운 투자 수익 (ROI) 설정을 선택합니다 (그림. 4C, 빨간색rrow). 630 그레이 스케일 수준에서 임계 값 알고리즘을 사용하도록 설정을 조정하고이의이 기록되어있는 모든 잠재적 인 ROI (그림. 4C)을 보장하기 위해 크기가 최대 제한 해제합니다. 참고 : 임계 값 설정이 이미지에 캡처 된 형광 신호 강도에 따라 연구에 연구 다를 수 있습니다. 이미지는 아직 종양 덩어리에서 신호를 정량 동물의자가 형광의 배경에서 신호를 측정하지 않는 임계 된. 이미지 디스플레이 창 내에서 마스크 기능을 선택합니다. 이제 동일 값 또는 630 계조 레벨의 임계 값을 초과이 화소에 대응하는 영역 만이 표시 될 것이다. 정량적 인 결과가 상단 메뉴 표시 줄을 선택 디스플레이 탭 (그림. 4D, 빨간색 화살표)에서 분석 탭을 선택합니다 볼 수 있습니다. 디스플레이 메뉴에서 일련 번호, 합계, 평균, 및 면적 확인란을 선택하고 확인을 클릭합니다. 값이 전 할 수 있도록 이미지를 저장따라서 이식 한 번 모든 형광 이미지 처리됩니다. 다음으로, X 선 이미지를 선택하고 다시 상단 메뉴 표시 줄에서 이미지 디스플레이를 엽니 다. 마우스 골격의 가장 시각적 표현을 제공하는 최소, 최대 및 감마 값을 설정합니다. 주 : 정량은 시계열에서 각 X 선 화상을 처리 할 수있는 X 선 영상에서 수행되지 않기 때문에 (즉, 최소, 최대 및 감마값)은 데이터 세트의 가장 찾고 표현을 생성하기 위해. 다시 X 선 이미지와 오버레이 확인란을 선택하고 메뉴 (그림. 4E) 드롭 다운에서 해당 형광 이미지 파일 이름을 선택 강조했다. 오버레이 출력을 추출하려면 왼쪽 탐색 메뉴 (그림. 4B, 파란색 화살표)에서 주석 탭을 선택합니다. 형광 강도 데이터 신속 메신저로부터 결정될 수 있도록 추가적인 데이터 또는 텍스트를 추가하고 마지막 강도 눈금 막대를 추가하기위한 적절한 탭을 선택나이. 주석 강조 표시에 대한 모든 주석 페이지에 개체 및 상단에있는 편집 메뉴에서 복사를 선택하고 해당 파일에 오버레이 이미지 데이터를 붙여 넣습니다 (예 : 워드, 파워 포인트, 및 / 또는 Photoshop)을 완료되면. 단계를 반복 6.1 시퀀스의 형광 X 선 이미지의 모든 쌍에 대한 6.11. 을 닫기 전에 안전한 모든 이미지에해야합니다. 최종 정량 동시에 모든 형광 이미지를 열고 상단 창 메뉴에서 타일을 선택합니다. 다음 데이터를 볼 수 모두 내보내기 열기 문서를 선택합니다. 참고 : 엑셀 프로그램이없는 경우, 탭의 선택을 취소합니다. MI는 탭으로 구분 된 텍스트 추가 분석을 위해 적절한 컴퓨터로 전송 될 수있다 (즉,이 .txt) 파일을 생성합니다.