Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.
Широкий спектр методов в настоящее время доступны для определения константы диссоциации между белком и взаимодействующих небольших молекул. Тем не менее, большинство из них требуют доступа к специализированным оборудованием, и часто требуют степень экспертизы, чтобы эффективно создать надежные эксперименты и анализировать данные. Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) все чаще используется в качестве надежного способа первичного скрининга белков для взаимодействия малых молекул, либо для выявления физиологических партнеров или для открытия хит. Этот метод имеет то преимущество, что она требует только машину, подходящую для ПЦР количественной ПЦР, и таким образом, подходящие приборы доступна в большинстве учреждений; превосходный диапазон протоколов уже доступны; и есть все основания прецеденты в литературе для многократного использования метода. Прошлая работа предложил несколько способов расчета константы диссоциации из данных DSF, но это математически требовательный. Здесь мы деммонстрировать метод оценки константы диссоциации с умеренным количеством DSF экспериментальных данных. Эти данные, как правило, могут быть собраны и проанализированы в течение одного дня. Мы показываем, как разные модели могут быть использованы, чтобы соответствовать данные, полученные от простых обязательных мероприятий, и где кооперативного связывания или независимые сайты связывания присутствуют. Наконец, мы приведем пример анализа данных в случае, когда стандартные модели не применяются. Эти методы иллюстрируются по данным на коммерчески доступных белков управления, и двух белков из нашей исследовательской программы. В целом, наш метод обеспечивает простой способ для исследователей быстро получить дальнейшее понимание белка-лиганд с использованием DSF.
Все белки связываются с разной сродства, для широкого круга других молекул из простых ионов в других крупных макромолекул. Во многих случаях, белки связываются с малых партнеров молекул в рамках своей нормальной функции (например, киназа связывания с АТФ). Другие взаимодействия может быть не связан с функцией, но экспериментально полезны в качестве инструментов (например, малых молекул, которые стабилизируют белки улучшить успех кристаллизации, или оказания помощи в поддержании белки в растворе); в то время как малые молекулы, которые связываются с активными центрами и аллостерическими сайтами белков могут действовать как ингибиторы, так и модулируют активность ферментов.
Есть широкий спектр методов, которые могут быть использованы для определения аффинности белков для молекул-партнеров. Изотермический титрования калориметрии 1 широко рассматривается как «золотой стандарт», так как он обеспечивает богатую информацию о реакциях, является этикетка бесплатно, и ограниченные возможности дляrtifacts эксперимента. Тем не менее, несмотря на недавние улучшения в чувствительности измерительных приборов и автоматизации экспериментальной установки, это все еще относительно дорогим с точки зрения потребностей в белке, в лучшем случае низкого и среднего пропускную способность, и лучше всего подходит для взаимодействия с умеренной высокое сродство (10 нм до 100 мкм K D) 2. Другие этикеток бесплатных методы, такие как поверхностного плазмонного резонанса или двухслойной интерферометрии 3 предложения более высокой производительности, и добились чувствительность для обнаружения молекул меньшего размера, как низкие, как 100 Da. Тем не менее, высокие пропускная инструменты для этих методов сравнительно дорого, оправданы только там, где будет постоянное пропускная соответствующих проектов, и так, вероятно, будут недоступны для многих академических лабораториях.
Дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF, или thermofluor) был впервые описан в 2001 году 4 в качестве метода для обнаружения наркотиков. В этом метод, белки инкубировали с флуоресцентным красителем (первоначально были использованы нафталин-сульфоновой красители), который изменяет свое флуоресценции при связывании с гидрофобными участками белков. Образец белка с красителем затем нагревают, а также мониторинг флуоресценции по мере возрастания температуры. Разворачивание белка, а также воздействие гидрофобных частей белка, приводит к характерным рисунком в флуоресценции в зависимости от температуры (фиг.1А). Эксперимент может быть выполнена в небольших объемах в любом коммерческом количественной ПЦР инструмента, и таким образом, в одном эксперименте, большое количество образцов одновременно могут быть проверены (обычно 48, 96 или 384 образцов, в зависимости от модели прибора). Опыты, как правило, могут быть выполнены в вокруг часов, что обеспечивает возможность высокопроизводительного анализа образцов 5.
Дальнейшее совершенствование методологии видели принятие красителей с лучшими спектральными свойствами 6,7 </вир>, генетические методы для анализа данных, и предложил протоколы для первичного скрининга 8,9. Область применения метода была расширена, с особым акцентом на создание оптимальных условий для подготовки и хранения белков 10, и на выявлении потенциальных партнеров по связыванию, чтобы помочь кристаллизации 11. Относительно высокая пропускная способность метода, относительно низкая стоимость белком (~ 2 мкг на реакции), и применимость к изучению слабых связывающие молекулы сделал DSF собой ценный инструмент для фрагмента на основе разработки лекарств, особенно в академическом контексте 12-14.
Несмотря на широкое применение DSF к изучению белок-лиганд, несколько исследований описано определение констант диссоциации этих исследований. Тем не менее, эти, как правило, производят подробные уравнения, описывающие развертывание белка, по многим параметрам, которые должны быть установлены в разреженных данных или в некоторых случаях еstimated 7,15-17. Эти методы имеют особое значение в сложных случаях, например, плотно обязательных соединений, или белков отображаются необычные переходы. Тем не менее, для многих лабораториях, эти подробный анализ слишком громоздки для повседневного использования. Поэтому мы предлагаем альтернативные методы лечения для различных сценариев, и продемонстрировать, как они могут быть использованы, чтобы соответствовать данные, вытекающие из различных белковых-лиганд. Наш метод использует инструмент StepOne КПЦР, для которых программное обеспечение для анализа на заказ данные доступны; пока это ускоряет анализ данных, результаты других инструментов могут быть обработаны с использованием ранее опубликованных методов 9, и то же самое после анализ может быть проведен.
Дифференциальная сканирующая флуориметрия продемонстрировала свою силу в качестве надежной и универсальной метода для характеристики белков, и выявления потенциальных лигандов белка. Хорошо задокументированные успехи в ускорении стабилизации белка, лекарств (особенно в менее финансируемых лабораторий) и кристаллизация 10,23-25 сделали его привлекательным методом для начального скрининга соединений. Соединения, добавленные к белкам показывают четкое зависимое от дозы увеличение кажущейся температурой плавления 7,9. Тем не менее, не было сделано попытки использовать результаты этих экспериментов, чтобы определить, кажущиеся константы связывания, чтобы помочь в рейтинге соединений на их сродство. Здесь мы представляем метод для определения систематически кажущуюся константу диссоциации белков в присутствии лиганда.
Представленные здесь результаты показывают, что DSF могут быстро и решительно дают оценки константы диссоциации дляСочетание белок-лиганд. Наблюдаемые данные можно манипулировать с коммерчески доступных инструментов, чтобы обеспечить быстрое определение Уб, без необходимости делать предположения относительно вероятной стоимости параметров. Этот метод имеет существенное преимущество по сравнению с сопоставимыми некоторых методов быть экономной в белка и времени, необходимого. Эксперимент, описанный здесь будет потреблять 0,13 мг белка на эксперименте (приблизительно 0,4 мг для экспериментов повторяются в трех экземплярах). Это выгодно отличает изотермический титрования калориметрии (ITC), где один эксперимент со средним 40 кДа белка будет потреблять такое же количество. Полный набор экспериментов, необходимых для этого протокола будет потреблять около 4 ч, в том числе подготовки, для одного набора экспериментов. Опять же, это, вероятно, будет значительно быстрее, чем методы, такие как ITC или поверхностного плазмонного резонанса, который, пока мощная часто требуют существенной оптимизации для достижения наилучших данных.
Наши результаты показывают, что остается требование, чтобы внимательно изучить исходные данные, пригодный этих данных для определения температуры плавления, и подходят данных температуры плавления, чтобы определить константу диссоциации. Первая задача заключается в форме исходных данных, полученных при плавлении белка. В некоторых случаях, форма не может приблизиться к тому, что наблюдалось на фиг.1А. Общие вопросы включают низкие сдвиги температуры на связывание лиганда, высокий фоновой флуоресценции и необычные множественные переходы температуры. Низкие сдвиги температуры наблюдаются на связывание ряд лигандов. Для этого метода, наиболее важным параметром является ошибка в измерении Т м, по сравнению со сдвигом температуры. Данные могут быть установлены, как правило, достаточно хорошо, когда стандартное отклонение трех измерений не превышает 10% от температуры плавления сдвигом между несвязанного и полностью связанного белка. Наш опыт показывает, что там, где такие температурыратуре сдвиги только 2 ° С, это может быть достаточным для подгонки данных, если отдельные точки данных с высокой точностью. Второй вопрос заключается в необычной формы кривых. Они часто отличаются от свободного белка и лиганда, связанного форм, как связывания лиганда влияет на раскрытие режимы белка. В этих случаях, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, что данные могут быть использованы с соответствующим учетом моделей, которые будут использоваться для определения температуры плавления и константу диссоциации. Еще одна распространенная проблема в том, что добавление кофактора к белку (например, MgCl 2 в нашем примере с гексокиназой) требуется для получения наиболее достоверных данных. Наш опыт показывает, что тщательное рассмотрение всех вероятных факторов в эксперименте на стадии принятия начальные показания необходимо получение наилучших результатов. Кроме того, альтернативные теоретические методы лечения могут выявить особенности этих данных 15,17. Наконец, это не редкость для некоторых белков, которые сontain изначально подвергается гидрофобные участки, чтобы показать высокий фоновой флуоресценции. Есть ряд решений этих проблем, которые были широко отзывы других 6,9.
В частности, пользователь должен рассмотреть вопрос о том, чтобы использовать Больцмана или его производные модели (например, фиг.4), и в случае использования производных, независимо от того, должны быть смоделированы несколько расплавов. Эти два метода моделирования тепловой разворачивается отличаются тем, что метод Больцмана подходит экспериментальные данные для уравнения Больцмана, предполагая регулярное сигмоидального форму к разворачивающейся кривой. В отличие от этого, производное метод принимает первую производную экспериментальных данных в каждой точке (нижняя панель на фиг.1А), и считает температуру плавления, чтобы быть самой высокой точкой первой производной. Производное метод возвращает как правило, более высокую температуру плавления примерно на 2 – 3 ° С. Большинство белков вернется более последовательнымРезультат (то есть, стандартная ошибка температуры плавления для тройных опытах ниже) для одного из двух методов. Это, как правило, тесно связаны с точной формы разворачивания белка кривую, и надо эмпирически определить наилучший метод в каждом конкретном случае. Там, где используется производная модель, важно также рассмотреть несколько событий плавления. Некоторые данные ясно показывают доказательства для нескольких переходов, и в этих случаях результаты, скорее всего, будет легче определить, если эти несколько событий плавления моделируются. В контексте этого протокола, то это часто бывает, что добавление лиганда может вызвать белок перейти от наличия нескольких переходов плавления к одному перехода (например, путем стабилизации наиболее термически хрупкий субдомен), или наоборот. Поэтому мы бы посоветовали, что исходные данные рассматриваются вместе, прежде чем рассматривать, какой подход будет лучше всего использовать.
После мodelling отдельных температур плавления, дальнейшие проблемы могут возникнуть в связи с настройкой их на модели, представленные в разделе протокола. Крайне важно, чтобы внимательно изучить подгонку к константы диссоциации уравнения, используя логарифмическую шкалу, как этот анализ часто подчеркивает расхождения между данными наблюдений и модели (е .g., Рисунок 3). Хотя полученные результаты, как правило, надежные, уход в интерпретации дает возможность извлекать лучшие результаты, а самое значение, в соответствии с данными.
Особым вопросом поднят этих данных является интерпретация, что должен быть сделан на белки, которые показывают кооперативности или нескольких обязательных мероприятий, в DSF. Мы, на сегодняшний день, только наблюдали это явление в белках, которые, как ожидается, несколько специфических связывающих события (например, WCBM, белок, лучше гомолог является мультимер 26, и который выступает в качестве мультимера на гель-фильтрации [данных неПоказано]). Это не совсем понятно, что отрицательный кооперативности наблюдается в DSF денатурации указывает на то, что фермент будет в конечном счете, показывают отрицательную кооперативность: а, это может быть показателем комплекс связывания, которые должны быть изучены более детально с использованием широкого спектра методов. Это позволяет предположить, к нам, однако, что более обширные исследования таких белков, вероятно, определить интересные эффекты.
Значения, приведенные для константы диссоциации, используя этот метод, как правило, из того же порядка, предоставленные другими методами, такими как изотермический титрования калориметрии и поверхностного плазмонного резонанса. Тем не менее, абсолютные значения, наблюдаемые часто выше, чем наблюдаемые с помощью этих методов. Это, по меньшей мере, частично является следствием того факта, что константа диссоциации наблюдается при температуре плавления белка с лигандом. Это Уб как правило, выше, чем при физиологических температурах. DissociatioN константа в зависимости от температуры реакции с помощью уравнений:
[1]
[2]
(Где с θ является стандартной ссылкой концентрация, Δ г G является Гиббс изменение свободной энергии реакции, R является газовая постоянная, Δ H является изменение энтальпии в реакции, и Δ S является изменение энтропии в реакции .)
Реакции с константы диссоциации в измеряемого диапазона этого метода, как правило, имеют отрицательный Δ R G, и поэтому эффект увеличения температуры на уравнения [1] будет увеличить константу диссоциации. Оба Δ H и Δ S термины, которые составляют свободную энергию Гиббса (уравнение [2]) являются TEMPERATURе зависит 27, и эффект от константы диссоциации будет зависеть от величины и знака этих температурных зависимостей, и обязательно будет зависеть взаимодействие. Следовательно, это не является неожиданным, что константы диссоциации, определенные с помощью этого метода, иногда больше, чем те, которые определены с помощью методов, которые работают при комнатной температуре. Температурная зависимость, конечно, также предостережение многих других методов, которые, как правило, чтобы обеспечить константу диссоциации при температурах более низких, чем физиологической температуре.
Другой предостережение метода DSF является то, что меченый метод, в отличие от ITC. Флуоресцентной метки использовали (SYPRO оранжевый) является гидрофобным, и поэтому в некоторых случаях может конкурировать со связыванием гидрофобных лигандов с белками. Следовательно, вполне вероятно, что в некоторых случаях, константа диссоциации получены будет поднят искусственно вследствие конкуренции с меткой. Однако, для сравнения различных лигандов, (основное применениеDSF), различия вряд ли достаточно значимы, чтобы влиять на ранжирование соединений близостью.
Потенциальным недостатком этого способа является пределом обнаружения, что может быть достигнуто. В принципе, это не должно быть возможным точно измерить значение K D, которая ниже, чем 50% от концентрации белка, и даже значения в этом диапазоне может быть сомнительной точности. В то время как предел обнаружения на этом конце диапазона может быть продлен немного за счет снижения концентрации белка и красителя, чувствительность прибора позволит предотвратить дальнейшее снижение концентрации белка. Кроме того, верхний конец чувствительности будет определяться растворимости лиганда. Для получения математически надежную оценку для K D, очень важно, чтобы получить данные с 90% белка, присутствующего в лиганд-связанной форме, которая требует концентрации лиганда с приблизительнолы в десять раз Уб (при условии отсутствия кооперативности). Предел обнаружения будет поэтому обязательно одна десятая растворимости лиганда в соответствующем буфере. Это означает, что пределы обнаружения метода, как правило, в диапазоне от 1 мкм и от 1 до 100 мм, в зависимости от белка и лиганда.
В заключение, дифференциальная сканирующая флуориметрия является универсальным метод применим к широкому диапазону белков. Используя методы, представленные здесь, можно быстро и недорого определить сродство белка при различных лигандов. Это имеет большой потенциал для применения в очистке белков и стабилизации, выяснения функции или специфичности ферментов из метагеномов, и в разработке лекарств, особенно в небольших лабораториях.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.
StepOne real time PCR instrument | Life Technologies | 4376357 | DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis. |
Protein thermal shift software v1.0 | Life Technologies | 4466037 | |
MicroAmp Fast optical 48-well plates | Life Technologies | 4375816 | |
Optical sealing tape | Life Technologies | 4375323 | Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier |
U-bottomed 96-well plates | Fisher | 11521943 | |
SYPRO Orange | Life Technologies | S6650 | For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692 |
SPSS statistics version 20 | IBM | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
GraphPad Prism 6.02 | GraphPad | N/A | Other statistics packages will provide similar functionality |
Hand applicator (PA1) | 3M | 75-3454-4264-6 | |
Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | H5000 | |
Glucose | Fisher scientific | 10141520 |