Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

La Figura 1 muestra un flujo de trabajo típico para formación de imágenes de microscopía electrónica celular 3D, incluyendo la tomografía de electrones, FIB-SEM, y SBF-SEM. El flujo de trabajo incluye la recolección de datos en bruto, la alineación y la reconstrucción de datos en un volumen 3D, reducción de ruido a través del filtrado, y cuando sea necesario, recortar la región de interés con el fin de maximizar la eficacia de la segmentación software elegido. Tales datos preprocesado está entonces listo para la extracción de características / segmentación. La Figura 2 ilustra el flujo de trabajo se establece en la Figura 1 con cuatro conjuntos diferentes de datos (que se introducirán más adelante), dos de los cuales son muestras incrustado en resina registrados por tomografía de electrones (figuras 2A, 2B), con los otros dos derivados de FIB -SEM y SBF-SEM, respectivamente (Figuras 2C, 2D). Imágenes en la figura 2 la columna 1 son la proyecciónVistas (Figuras 2A1, 2B1) y bloque de imágenes de la superficie (Figuras 2C1, 2D1), respectivamente, que tras la alineación y la reconstrucción se ensamblan en un volumen 3D. La columna 2 muestra rebanadas a través de este tipo de volúmenes en 3D, que en el filtrado (columna 3) muestran una reducción significativa en el ruido y por lo tanto a menudo aparecen más nítidas. Después de seleccionar y recortar el volumen 3D grande para la región de interés (columna 4), representaciones en 3D de funciones segmentadas de interés (columna 5) se pueden obtener y más inspeccionados, codificados por color y se analizó cuantitativamente. Un total de seis conjuntos de datos 3D, conteniendo cada uno una pila de imágenes obtenidas a través de cualquiera de tomografía de electrones (3) conjuntos de datos, FIB-SEM (2 conjuntos de datos), o SBF-SEM (1 conjunto de datos) se utilizan para comparar cómo cada uno de los cuatro métodos de segmentación realizan (Figura 3). Los conjuntos de datos se derivan de una variedad de diferentes proyectos de investigación en el laboratorio y por lo tanto proporcionan arconjunto easonably diverso de conjuntos de datos experimentales típicos. Todos los conjuntos de datos fueron examinados por cuatro investigadores independientes, cada uno de los cuales están más familiarizados con un método particular, y que fueron acusados ​​de proporcionar el mejor resultado posible para cada uno de los seis conjuntos de datos. Los conjuntos de datos son a partir de muestras de la siguiente manera: 1. Las figuras 3A1-3A5: de alta presión congelado, congelar-sustituido y embebido con resina polluelo pelo oído interno estereocilios celular 31, 2. Las figuras 3B1-3B5: alta presión-congelado, congelación sustituido y pared celular vegetal embebida de resina (no publicado), 3. Las figuras 3C1-3C5: alta presión congelado, helada-sustituido y embebido en resina interna cinocilio las células ciliadas del oído (no publicado), 4. figuras 3D1-3D5: alta presión- congelado, helada-sustituido y bloques incrustado en resina de las mitocondrias situadas en las glándulas mamarias células epiteliales humanos HMT-3522 S1 acinos, que han sido cultivadas en laminina extracelular ricamatriz ular 32,33, 5. Las figuras 3E1-3E5: sin manchas de sobremesa-procesado, bloques embebidos en resina de un reductor de sulfato de biopelículas bacterianas (manuscrito en preparación), y 6 figuras 3F1-3F5: límite de la membrana de las células vecinas de la HMT -3522 acinos S1. Como se puede ver en la figura 3, los diferentes enfoques de segmentación pueden conducir a resultados similares para la mayoría de algunos tipos de conjuntos de datos, pero completamente diferentes resultados para otro tipo de datos. Por ejemplo, el conjunto de datos estereocilios de las células ciliadas (Figura 3A) produce volúmenes razonables de segmentación con los cuatro enfoques, con el modelo abstracto Manual generada por un usuario experto siendo la más clara para interpretar y medida. En este caso, dicho modelo permite mediciones rápidas de distancias de filamentos filamentos, contando el número de enlaces que se encuentran entre los filamentos alargados, así como la determinación de las partes faltantes de la mapa de densidad correspondientesa lugares donde el espécimen fue dañado durante la preparación de la muestra 34. Dicha información es mucho más difícil de adquirir mediante el uso de los otros tres enfoques de segmentación, aunque la segmentación automatizada hecho a medida ofrece mejores resultados que el umbral puramente densidad basados. Para la pared celular de la planta (Figura 3B), la generación de modelo manual parecía ser el más eficiente en la transmisión de un sentido de orden en la pared celular, que ninguno de los otros enfoques lograr. Sin embargo, el modelo abstracto no captura el hacinamiento de los objetos en el conjunto de datos. Manual de funciones de interés rastreo parece dar un mejor resultado que los enfoques supervisados ​​en forma a base de la densidad o. Por otro lado, el trazado manual es muy intensiva en trabajo y la identificación de las fronteras de las características es algo subjetivo. Por lo tanto, los enfoques automatizados pueden ser preferidos para la segmentación de grandes volúmenes con un potencial de compromiso entre la precisión yrecursos gastados en la segmentación manual. Para el conjunto de datos cinocilio (Figura 3C), manual de generación del modelo abstracto produce el resultado más limpio y revela una arquitectura inesperada de tres microtúbulos en el centro de la cinocilio, un detalle que es fácilmente visible en los datos recortadas, pero perdió en todos los otros enfoques , presumiblemente debido a manchar heterogeneidad. Sin embargo, otras características potencialmente cruciales del mapa de densidad se pierden en la generación manual de un modelo abstracto. Esto es debido al hecho de que la naturaleza subjetiva de la formación de modelo manual conduce a una idealización y la abstracción de la densidad real observado, y por lo tanto a una interpretación subjetiva durante la formación del modelo. Por lo tanto, este ejemplo demuestra cómo bien manual de generación de modelo abstracto le permite a uno concentrarse en un aspecto específico del volumen 3D. Sin embargo, la percepción selectiva y la simplificación no logra hacer una relación completa de todos los co proteínamplexes presentes en el conjunto de datos. Por lo tanto, si el objetivo es mostrar la complejidad de los datos, entonces uno está mejor servido con cualquiera de los otros tres enfoques. En el caso de la glándula mamaria acinos-matriz cultivadas 3D (Figura 3D), las mitocondrias de alto contraste están segmentados por los cuatro enfoques con facilidad, con el trazado manual de características de rendimiento no es demasiado sorprendente los mejores resultados con la menor cantidad de contaminación ( Figura 3D3). Sin embargo, el trazado manual es muy intensiva en trabajo y por lo tanto es de uso limitado para grandes volúmenes. Tanto umbral basado en la densidad y la segmentación automatizada de forma supervisada extraen las mitocondrias bastante bien, y daría lugar a una segmentación casi perfecto, si se emplean más trucos para la limpieza (por ejemplo, la eliminación de todos los objetos por debajo de un determinado umbral de densidad voxel) como disponible en diferentes paquetes. En este caso, manual de construcción de modelos abstraído no dióresultados prometedores, en parte debido a que las mitocondrias no pueden fácilmente ser aproximadas con los modelos de bola y el palo. Con respecto a la comunidad bacteriana del suelo / biopelícula (Figura 3E), tres de los cuatro enfoques obtener resultados razonables, con la generación modelo manual no realizar bien debido al desafío de la representación de objetos biológicos, tales como bacterias, por formas geométricas. Apéndices extracelulares procedentes de las bacterias se pueden detectar en los enfoques de segmentación automatizados pero no tan bien en la localización característica manual. Supervisado en forma de segmentación automatizada hecho a medida puede separar aún más las funciones extracelulares de las bacterias a pesar de sus densidades similares (datos no presentados), lo que permite un fácil cuantificación, incluso de conjuntos de datos extremadamente grandes. Debido a que este es originalmente un conjunto de datos muy grande, la segmentación automatizada hecho a medida outcompeted claramente todos los otros enfoques, pero puede haber beneficiado de la baja complejidady la distribución relativamente escasa de los objetos de interés (bajo hacinamiento). Al examinar la interfaz entre dos células eucariotas en un contexto similar a un tejido (Figura 3F), sólo el trazado manual de las características de interés produce buenos resultados. Enfoques automáticos de segmentación basado densidad no detectan el límite membrana entre células adyacentes por completo, e incluso los enfoques hechos a medida falla, en parte debido a la forma de una célula no es fácil de aproximarse o equipararse con formas, a pesar de su éxito claro para las bacterias en el biofilm (Figura 3E5). La observación de la Figura 3 que los enfoques de segmentación hacen bien en algunos conjuntos de datos, pero no en otros llevó a la cuestión de lo que caracteriza a cada uno de estos conjuntos de datos, y si es posible categorizar los tipos de características de los datos o los objetivos personales que parecían coincidir bien con su respectivenfoque e. El estudio sistemático de este tema no se ha realizado previamente, y por lo tanto, como primer paso al establecimiento de una lista empírica de características de la imagen y los objetivos personales puede guiar a un novato en su intento de encontrar el mejor enfoque para la extracción de características de su respectiva serie de datos. Se identificaron ocho criterios tan importantes se muestran en la Figura 4, y se pueden dividir en dos categorías principales: (1) las características que son inherentes al conjunto de datos, y (2) los objetivos personales del investigador y otras consideraciones que son algo más subjetiva, aunque igualmente importante. Los ejemplos mostrados se dibujan predominantemente a partir de los seis conjuntos de datos en la Figura 3, con tres conjuntos de datos adicionales están introduciendo: uno (Figura 4A1) es un crio-tomografía de una sección crio de la pared celular vegetal Arabidopsis thaliana, la segunda (figuras 4A2 , 4B1, 4D1 </strong>) es un FIB / SEM conjunto de datos de la estría vascular del oído interno, que es un tejido muy complejo y enrevesado que podrían encajar en la categoría representada en las figuras 3F1-3F5 pero es aún más complejo sustancialmente, y el tercero (figuras 4B2 , 4D2) es una sección de resina de tomografía interior estereocilios de las células ciliadas del oído en vista en sección transversal, similar al contenido de la muestra se muestra en la vista longitudinal en Figuress 2A1-2A5 y 3A1-3A5. Para la categoría de los criterios objetivos como características de la imagen, se proponen cuatro rasgos inherentes a los conjuntos de datos de importancia: El contraste de datos puede ser (1) baja (Figura 4A1) como es típico para las tomografías crio-EM, (2) intermedia (Figura 4A2) tales como en escenarios celulares sin orgánulo clara u otra característica prominente de pie, o (3) de alta (Figura 4A3), como es el caso para el kinocitomografía liary o los estereocilios en sección transversal, debido a la alineación de los elementos filamentosos claramente separados dentro de la dirección z. Los datos pueden ser difusa (Figura 4B1), sin límites visiblemente claras entre dos objetos estrechamente posicionado, tales como células en un tejido, o crujientes (Figura 4B2), con límites bien definidos. Esto es en parte una función de la resolución de conjunto de datos, que es inherentemente superior por un factor de alrededor de 2-4 para tomografías de electrones en comparación con el FIB-SEM. Naturalmente, los límites más nítidos son deseables para ambos manual, así como los enfoques de segmentación automatizada, pero esencial para el último enfoque. Los mapas de densidad puede ser lleno (Figura 4C1) tal como se refleja por los componentes de la pared celular vegetal estrechamente espaciados, o escasamente poblada (Figura 4C2), como son las bacterias en una colonia, que ejemplifica la separación que hace que la segmentación de imágenes automatizado sustancialmente más fácil. Mapas de densidad pueden ser altamente complejo con muy diferentes características a menudo con formas irregulares, como el tejido de la estría vascular alrededor de un vaso sanguíneo (Figura 4D1) o objetos-orgánulos como bien definidas con una organización similar, como los estereocilios en sección transversal ( Figura 4D2). También tenga en cuenta las muy diferentes escalas en los diferentes ejemplos, por lo que la comparación un tanto difícil. Además de los criterios más objetivos, como características de la imagen, cuatro criterios altamente subjetivos que guiarán la selección de la ruta adecuada también se proponen: Objetivo deseado: El objetivo puede ser para visualizar el haz estereocilio pelo en su complejidad y para determinar y examinar la forma del objeto (Figura 4E1), o para crear un modelo de bolas y palo simplificado y resumido que se construye en el mapa de densidad y permite un conteo rápido de unand medición de los objetos geométricos (longitud del filamento, la distancia y el número de conexiones) (Figura 4E2). La morfología característica puede ser muy irregular y complejo como las células, como las zonas de interacción célula-célula (Figura 4F1), algo de forma similar con algunas variaciones, tales como las mitocondrias (Figura 4F2), o en su mayoría de forma idéntica, tales como filamentos de actina y cruz enlaces en un haz de pelo en la orientación longitudinal (Figura 4F3). La proporción de la característica de interés (densidad de población) es importante, ya que uno puede desear para segmentar todas las características de un conjunto de datos 3D, como es el caso de las paredes celulares de las plantas (Figura 4G1), o sólo una pequeña fracción del volumen celular como es el caso de las mitocondrias en una escena celular heterogénea (Figura 4G2). Dependiendo del tamaño del conjunto de datos y el porcentaje de volumen que requiere la segmentación, puede ser más eficaz utilizarenfoques manuales. En otros casos, como cuando uno está interesado en una variedad de características, simplemente no hay alternativa al uso de métodos semiautomáticos de segmentación. Otro criterio subjetivo clave es la cantidad de recursos que uno esté dispuesto a invertir en el proceso de segmentación y qué nivel de fidelidad es necesaria para responder a una cuestión biológica. Uno puede querer y necesidad de cuantificar los parámetros volumétricos de una función (por ejemplo, tamaño, volumen, superficie, longitud, distancia de otras características, etc), en cuyo caso puede ser necesaria más atención para obtener información cuantitativa precisa (Figura 4H1), o el propósito puede ser simplemente tomar una foto de su forma 3D (Figura 4H2). En un mundo ideal, donde los recursos son ilimitados, uno claramente no querría asumir ningún compromiso, sino más bien optar por el camino más preciso de extracción de características Manual asistida usuario. Si bien esto puede funcionar para muchos conjuntos de datos, en un futuro próximo volúmenes 3D wil l estar en el orden de 10k por 10k por 10k o superior, y la segmentación manual ya no será capaz de jugar un papel destacado en la segmentación de un espacio tan enorme. Dependiendo de la complejidad de los datos y otras características de los datos, la segmentación semi-automatizado puede convertido en una necesidad. En la Figura 5, fortalezas y limitaciones se mencionan brevemente en los cuatro enfoques de segmentación. Los objetivos personales y características de la imagen identificados en la Figura 4 que se puede emparejar con cada enfoque se resumen así. En la figura 6, los objetivos personales y características de la imagen de los seis conjuntos de datos ejemplifican cómo triage datos y decidir sobre el mejor enfoque. Ambas figuras 5 y 6 se amplían en la discusión. carga / 51673 / 51673fig1highres.jpg "width =" 500px "/> Figura 1 Flujo de trabajo para la reconstrucción de imágenes biológicas y análisis. Esta tabla ofrece una visión general de las diversas medidas adoptadas para recopilar y procesar imágenes recogidas por la tomografía, se centró haz de iones SEM, y la cara del bloque de serie SEM. Primas resultados de la recopilación de datos en serie de inclinación 2D o secciones seriadas. Estos conjuntos de imágenes 2D deben estar alineados y reconstruidos en 3D, después se filtró con el fin de reducir el ruido y mejorar el contraste de las características de interés. Por último, los datos pueden ser segmentadas y analizadas, lo que se traduce en un modelo 3D. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2.. Ejemplos de flujo de trabajo para los diferentes tipos de datos de la tomografía y FIB-SEM Cada paso del flujo de trabajo después de la recopilación de datos se muestra a través de cuatro grupos de datos (filas AD): resina incrustados tomografía manchado de estereocilios seccionada longitudinalmente, resina incrustada tomografía manchado de la pared celular vegetal celulosa, FIB-SEM de mama mitocondrias de las células epiteliales, y SBF-SEM de E. bacterias coli. Una rebanada 2D a través de los datos en bruto se muestra en la columna 1, y una imagen de los datos después de la alineación y la reconstrucción 3D comprende la columna 2 Las técnicas de filtrado aplicadas en la columna 3, son los siguientes: filtro de mediana (A3), filtro de difusión no anisotrópico (B3), desenfoque gaussiano (C3), y el filtro imadjust de MATLAB (D3). Un ejemplo de la mejor segmentación para cada conjunto de la superficie cultivada de interés (columna 4) los datos se muestra como una representación 3D de la columna 5. barras de escala: A1-A3 = 200 nm, A4 = 150 nm, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, alquilo C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 Aplicación de cuatro segmentación se acerca a los conjuntos de datos de ejemplo de conjuntos de datos Seis ejemplo fueron segmentados por los cuatro enfoques:. Manual de generación abstracta modelo, copiado manual, segmentación automatizada basada en la densidad y la segmentación automatizada a medida. Manual generación modelo abstracto fue eficaz para la resina incrustada tomografía manchado de estereocilios (A), ya que el objetivo era crear un modelo con fines cuantitativos en lugar de extraer las densidades. Para la resina incrustada tomografía manchado de la pared celular vegetal (B), Segmenta automatizado basado en la densidadción era el método más eficaz para extraer rápidamente la celulosa a través de muchas rebanadas, donde como los métodos manuales tuvieron mucho más esfuerzo en sólo unos pocos trozos de datos. Manual de generación del modelo abstracto generado el triplete de microtúbulos en el manchado de la tomografía cinocilio (C), mientras que otros métodos de segmentación no lo hicieron, sin embargo, los dos enfoques automatizados extrae las densidades más rápidamente y por lo tanto se prefiere. Debido a la forma de las mitocondrias de FIB-SEM de células epiteliales de mama (D), el trazado manual proporcionado el resultado más limpio, y la baja densidad de población combinado con el uso de métodos de interpolación permitidos para la segmentación rápida. Dado el gran volumen que necesitaba ser segmentada, adaptada a la medida de segmentación automatizada demostró ser más eficaz para segmentar las bacterias datos SBF-SEM (E), pero ambos enfoques automáticos fueron comparables. Aunque mucho tiempo, el único método para extraer el FIB-SEM de la membrana de células epiteliales de mama (F) fue trazado manual Escala Bares.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, bares = 500 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra. Figura 4. características de la imagen del objetivo y los objetivos personales subjetivas para triage de los conjuntos de datos. Usando ejemplos del conjunto de datos características, se proponen criterios para informar a una decisión en cuanto a cuál es el enfoque de segmentación de usar. Con respecto a las características objetivas, los datos sí pueden tener contraste que es bajo, medio o alto (A1-A3), ser difusa o crujientes (B1-B2), espaciados o lleno (C1-C2), y tienen complejo o simplemente características organizados (D1-D2). Objetivos personales subjetivas incluyen el o deseada bjetivo dirigidas a un modelo simplificado o la extracción de las densidades exactas (E1-E2), la identificación de una hoja enrevesado, complicado volumen, o la morfología lineal como la característica de interés (F1-F3), la elección de una alta o baja densidad de población de la característica de interés (G1-G2), y decidir sobre el equilibrio entre alta fidelidad y alta de asignación de recursos para un rendimiento decreciente de las inversiones, como el tiempo (H1-H2) Escala Bares:. A1 = 50 nm, A2 = 1,500 nm , A3 = 100 nm, 1500 nm = B1, B2 = 200 nm, C1 = 100 nm, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, E1 = 100 nm, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, G1 = 100 nm, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. px "/> Figura 5 Cuadro comparativo de las características de los datos y subjetiva tiene como objetivo apropiado para diferentes enfoques de segmentación. Esta tabla resume las fortalezas y limitaciones de cada enfoque de segmentación. Los criterios de la Figura 4 puede ayudar a identificar qué datos son adecuados para el método de segmentación. Estas características de la imagen objetivas y objetivos personales subjetivas fueron elegidos para un uso óptimo de cada enfoque, pero diferentes combinaciones pueden dificultar o ayudar a la eficacia de la segmentación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. Decisión diagrama de flujo para una eficiente tmonio de la segmentación se acerca para conjuntos de datos con diferentes características. Sobre la base de las características resaltadas en la Figura 4, este diagrama ilustra que cuatro criterios contribuyeron más a la decisión final sobre el mejor enfoque de segmentación para cada conjunto de datos de la Figura 3. Cada conjunto de datos es un código de color para seguir rápidamente las líneas gruesas representan el proceso de toma de decisiones primaria, así como las líneas de puntos que reflejan una ruta alternativa que pueden o no conducir a la misma aproximación. Los cinocilio, bacterias y conjuntos de datos de la pared celular vegetal fueron mejor segmentados con los dos enfoques automatizados. En contraste, los caminos de la membrana celular y las mitocondrias siempre conducen a trazado manual, debido a sus características difíciles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.