Da Voxels alla Conoscenza: Una guida pratica per la segmentazione del Complesso microscopia elettronica 3D-Data

La Figura 1 mostra un tipico flusso di lavoro per la microscopia elettronica imaging 3D cellulare, compreso tomografia elettronica, FIB-SEM, e SBF-SEM. Il flusso di lavoro comprende la raccolta di dati grezzi, l'allineamento dei dati e la ricostruzione in un volume 3D, riduzione del rumore attraverso il filtraggio, e, quando necessario, il ritaglio per la regione di interesse, al fine di massimizzare l'efficacia del software di segmentazione scelta. Tali dati pre-elaborato è quindi pronto per estrazione di caratteristiche / segmentazione. La figura 2 illustra il flusso di lavoro disposte in Figura 1 con quattro insiemi diversi di dati (che saranno introdotti più avanti), di cui due campioni di resina-embedded registrati da tomografia elettronica (figure 2A, 2B), con gli altri due, determinati dalla FIB -SEM e SBF-SEM, rispettivamente (Figure 2C, 2D). Immagini in Figura 2 colonna 1 sono di proiezioneviste (Figure 2A1, 2B1) e immagini superficiali blocco (Figure 2C1, 2D1), rispettivamente, che al momento l'allineamento e la ricostruzione sono assemblati in un volume 3D. Colonna 2 mostra fette attraverso tali volumi 3D, che su di filtraggio (colonna 3) mostrano una significativa riduzione del rumore e quindi spesso appaiono più nitide. Dopo aver selezionato e ritagliare il grande volume 3D per la regione di interesse (colonna 4), rendering 3D di caratteristiche segmentate di interesse (colonna 5) possono essere ottenuti e ulteriormente controllati, colore codificati e analizzati quantitativamente. Un totale di sei set di dati 3D, ciascuna contenente una pila di immagini ottenute sia attraverso la tomografia elettronica (3 insiemi di dati), FIB-SEM (2 set di dati), o SBF-SEM (1 set di dati) vengono utilizzati per confrontare come ciascuno di i quattro metodi di segmentazione eseguire (Figura 3). I set di dati derivano da una varietà di diversi progetti di ricerca in laboratorio e fornire così arinsieme eterogeneo di easonably tipici insiemi di dati sperimentali. Tutti i set di dati sono stati esaminati da quattro ricercatori indipendenti, ognuno dei quali sono più familiarità con un particolare approccio, e sono stati accusati di fornire il miglior risultato possibile per ciascuno dei sei insiemi di dati. I set di dati sono da campioni come segue: 1 Figure 3A1-3A5: alta pressione-congelato, congelamento-sostituiti e resina-embedded pulcino capelli dell'orecchio interno stereocilia cella 31, 2. Figure 3B1-3B5: alta pressione-congelato, freeze sostituito e parete cellulare vegetale in resina-embedded (inedito), 3. Figures 3C1-3C5: alta pressione congelato, congelare-sostituiti e interiore kinocilium cella capelli orecchio resina-embedded (inedito), 4. Figures 3D1-3D5: alta pressione- congelati, congelare-sostituiti e blocchi di resina-embedded di mitocondri situati in cellule epiteliali mammarie umane ghiandola HMT-3522 S1 acini, che sono state coltivate in laminina ricco Extracellmatrice lare 32,33, 5. Figure 3E1-3E5: senza macchia banco-Processing, blocchi di resina-embedded di un solfato riduttori biofilm batterici (manoscritto in preparazione), e 6 figure 3F1-3F5: confine membrana delle cellule vicine del HMT -3522 S1 acini. Come si può vedere dalla figura 3, differenti approcci di segmentazione possono portare a risultati analoghi principalmente per alcuni tipi di set di dati, ma risultati completamente differenti per altri tipi di dati. Ad esempio, il set di dati stereocilia delle cellule dei capelli (Figura 3A) produce volumi di segmentazione ragionevoli con tutti e quattro gli approcci, con il modello astratto manuale generato da un utente esperto di essere il più chiaro di interpretare e misura. In questo caso, tale modello consente misurazioni rapide di distanze filamento-incandescenza, contando il numero di collegamento trovato tra i filamenti allungati, nonché la determinazione delle parti mancanti della mappa di densità corrispondentedi luoghi in cui il campione è stato danneggiato durante la preparazione del campione 34. Tale informazione è molto più difficile da acquisire utilizzando gli altri tre approcci di segmentazione, anche se la segmentazione automatica su misura fornisce risultati migliori rispetto della soglia puramente densità-based. Per la parete cellulare delle piante (Figura 3B), generazione del modello manuale sembrava essere il più efficiente nel trasmettere un senso di ordine nella parete cellulare, che nessuno degli altri approcci raggiungere. Tuttavia, il modello astratto non cattura l'affollamento degli oggetti nel set di dati. Manualmente funzionalità di analisi di interesse sembra dare un risultato migliore rispetto agli approcci basati densità o forma-sorvegliate. D'altra parte, tracciamento manuale è molto laborioso e individuando confini delle caratteristiche è alquanto soggettiva. Pertanto, gli approcci automatizzati possono essere preferiti per la segmentazione grandi volumi con un potenziale trade-off tra precisione erisorse spese per la segmentazione manuale. Per il set di dati kinocilium (Figura 3C), manuale generazione modello sottratto produce il risultato più pulito e rivela un'architettura inaspettata di tre microtubuli al centro della kinocilium, un dettaglio che è facilmente visibile nei dati ritagliate, ma ha perso in tutti gli altri approcci , presumibilmente a causa di macchiare eterogeneità. Tuttavia, altre caratteristiche potenzialmente cruciali della mappa di densità sono mancati nella generazione manuale di un modello astratto. Ciò è dovuto al fatto che la natura personale della formazione modello manuale porta ad una idealizzazione e astrazione della densità effettiva osservata, e quindi ad una interpretazione personale durante la formazione del modello. Quindi, questo esempio che dimostra come manuale di generazione del modello astratto permette di concentrarsi su un aspetto specifico del volume 3D. Tuttavia, la percezione selettiva e la semplificazione non riesce a dare un resoconto completo di tutte le proteine ​​complexes presenti nel set di dati. Pertanto, se l'obiettivo è di mostrare la complessità dei dati, poi si è meglio servita con una qualsiasi delle altre tre approcci. Nel caso del 3D matrice colta ghiandola mammaria acini (Figura 3D), i mitocondri ad alto contrasto sono segmentati da tutti i quattro approcci con facilità, con il tracciamento manuale di caratteristiche non troppo sorprendente che producono i migliori risultati con l'importo più basso di contaminazione ( Figura 3D3). Tuttavia, tracciamento manuale è molto alta intensità di lavoro ed è quindi di limitata utilità per grandi volumi. Entrambi soglia basata sulla densità e la forma-supervisionato segmentazione automatizzata estrarre i mitocondri abbastanza bene, e si tradurrebbe in una segmentazione quasi perfetto, se sono impiegati altri trucchi per la pulizia (ad esempio, eliminando tutti gli oggetti al di sotto di una determinata soglia di densità di voxel) come disponibili in diversi pacchetti. In questo caso, manuale di costruzione di modello astratto non ha datorisultati promettenti, in parte perché i mitocondri non possono facilmente essere approssimate con modelli di palla e bastone. Per quanto riguarda la comunità batterica del suolo / biofilm (Figura 3E), tre dei quattro approcci forniscono risultati ragionevoli, con la generazione del modello manuale non funziona bene a causa della sfida di rappresentare oggetti biologici, come i batteri, di forme geometriche. Appendici extracellulari provenienti dai batteri possono essere rilevate negli approcci di segmentazione automatizzate ma non così bene nella funzione di tracciamento manuale. Forma-supervisionato segmentazione automatizzata su misura in grado di separare ulteriormente le caratteristiche extracellulari dei batteri nonostante le loro densità simili (dati non mostrati), consente una facile quantificazione anche estremamente grandi insiemi di dati. Perché questo è in origine un grande insieme di dati, la segmentazione automatica su misura chiaramente outcompeted tutti gli altri approcci, ma potrebbe aver beneficiato della bassa complessitàe la distribuzione relativamente scarsa degli oggetti di interesse (basso affollamento). Nell'esaminare l'interfaccia tra due cellule eucariotiche in un contesto di tessuto-like (Figura 3F), solo il tracciamento manuale delle caratteristiche di interesse ha prodotto buoni risultati. Approcci di segmentazione basata densità-automatici non riescono a rilevare il confine membrana tra cellule adiacenti del tutto, e anche gli approcci su misura non riesce, in parte perché la forma di una cellula non è facilmente approssimata o equiparato con forme, nonostante il suo evidente successo per i batteri nel biofilm (Figura 3E5). L'osservazione dalla Figura 3, che gli approcci di segmentazione fare bene su alcune serie di dati, ma non su altri ha portato la questione di ciò che caratterizza ciascuno di questi insiemi di dati, e se era possibile categorizzare i tipi di caratteristiche dati o scopi personali che sembravano abbinare bene con la loro respective approccio. Studio sistematico di questo tema non è stato precedentemente condotta, e, quindi, come primo passo uno stabilimento di un elenco empirica delle caratteristiche di immagine e obiettivi personali possono guidare un novizio nel loro tentativo di trovare l'approccio migliore per estrazione delle caratteristiche dei rispettivi set di dati. Otto criteri sono stati identificati come significativi sono mostrati in figura 4, e possono essere suddivisi in due categorie principali: (1) le caratteristiche che sono insiti nel set di dati, e (2) gli obiettivi personali del ricercatore e altre considerazioni che sono un po 'più soggettiva, anche se altrettanto importante. Gli esempi riportati sono prevalentemente tratte da sei set di dati in figura 3, con tre set di dati aggiuntivi in fase di introduzione: uno (Figura 4A1) è un crio-tomogramma di un crio-tratto di parete cellulare vegetale Arabidopsis thaliana, il secondo (Figure 4A2 , 4B1, 4D1 </strong>) è un FIB / SEM set di dati della stria dell'orecchio interno vascularis, che è un tessuto molto complesso e contorto che potrebbero adattarsi nella categoria raffigurato nelle figure 3F1-3F5, ma è ancora più sostanziale complessa, e il terzo (Figure 4B2 , 4D2) è una resina sezione del tomogramma interna stereocilia delle cellule dei capelli orecchio in sezione trasversale, simile al contenuto di esempio illustrato in vista longitudinale in Figuress 2A1-2A5 e 3A1-3A5. Per la categoria dei criteri oggettivi come le caratteristiche di immagini, quattro caratteristiche intrinseche nei set di dati sono proposti di importanza: Il contrasto di dati può essere (1) basso (Figura 4A1), come è tipico per le tomografie crio-EM, (2) intermedio (Figura 4A2), come ad esempio in scenari cellulari senza organello chiara o altra caratteristica prominente in piedi, o (3) ad alta (Figura 4A3), come è il caso per la kinocitomogramma acces- o stereocilia in sezione trasversale, causa l'allineamento degli elementi filamentosi chiaramente separati all'interno della direzione z. I dati possono essere sfocata (Figura 4B1), senza visibilmente chiari confini tra due oggetti strettamente posizionati, come le cellule in un tessuto, o croccanti (Figura 4B2), con confini ben definiti. Questo è in parte una funzione della risoluzione insieme di dati, che è intrinsecamente più elevato di un fattore di circa 2-4 per tomogrammi elettroni rispetto al FIB-SEM. Naturalmente, i confini più nitide sono auspicabili sia manuale così come gli approcci di segmentazione automatizzate, ma essenziale per il secondo approccio. Le mappe di densità possono essere sia affollato (Figura 4C1), come risulta dai componenti della parete cellulare vegetale ben distanziati, o scarsamente popolate (Figura 4C2), così come i batteri in una colonia, che esemplifica la separazione che rende automatizzato segmentazione dell'immagine sostanzialmente più facile. Le mappe di densità possono essere altamente complesso con caratteristiche molto diverse, spesso con forme irregolari, come il tessuto stria vascularis attorno ad un vaso sanguigno (Figura 4D1) o organelli oggetti simili ben definiti con una simile organizzazione, come stereocilia in sezione trasversale ( Figura 4D2). Da notare anche le molto diverse scale in tutti i diversi esempi, rendendo il paragone un po 'difficile. Oltre ai criteri più oggettivi, quali le caratteristiche di immagini, quattro criteri altamente soggettivi che guideranno la selezione del percorso appropriato sono anche proposti: Obiettivo desiderata: L'obiettivo può essere quello di visualizzare il fascio di capelli stereocilium nella sua complessità e per determinare ed esaminare la forma dell'oggetto (Figura 4E1), o per creare un modello di palla e bastone semplificata e astratta che è costruito nella mappa di densità e permette un veloce conteggio di unmisurazione nd degli oggetti geometrici (lunghezza filamento, distanza e numero di connessioni) (Figura 4E2). La caratteristica morfologia può essere molto irregolare e complessa come le cellule, come le zone di interazione cellula-cellula (Figura 4F1), un po 'simile forma con qualche variazione, come i mitocondri (Figura 4F2), o per lo più di forma identica, come i filamenti di actina e croce collegamenti in una fascio di capelli in orientamento longitudinale (Figura 4F3). La proporzione della caratteristica di interesse (densità di popolazione) è importante, come si può desiderare di segmento tutte le caratteristiche di un insieme di dati 3D, come nel caso di pareti cellulari delle piante (Figura 4G1), o solo una piccola frazione del volume cellulare come è il caso di mitocondri in una scena cellulare eterogenea (Figura 4G2). A seconda della dimensione del set di dati e la percentuale del volume che richiede segmentazione, può essere più efficiente utilizzareapprocci manuali. In altri casi, ad esempio quando si è interessati in una varietà di funzioni, semplicemente non c'è alternativa utilizzando approcci di segmentazione semi-automatica. Un altro criterio soggettivo fondamentale è la quantità di risorse si è disposti ad investire nel processo di segmentazione e quale livello di fedeltà è tenuto a rispondere a una domanda biologica. Si può desiderare e hanno bisogno di quantificare i parametri volumetrici di una caratteristica (quali dimensione, volume, superficie, lunghezza, distanza da altre funzioni, ecc), nel qual caso più attenzione può essere necessaria per ottenere informazioni quantitative precise (Figura 4H1), o lo scopo può essere quello di scattare solo una foto della sua forma 3D (Figura 4H2). In un mondo ideale in cui le risorse sono illimitate, uno chiaramente non vorrebbe scendere a compromessi, ma piuttosto optare per il percorso più accurata di estrazione delle feature manuale d'uso assistita. Anche se questo può funzionare per molti insiemi di dati, in un prossimo futuro volumi 3D wil l è nell'ordine di 10k da 10k da 10k o superiore, e la segmentazione manuale non sarà più in grado di svolgere un ruolo di primo piano nella segmentazione uno spazio così enorme. A seconda della complessità dei dati e altre caratteristiche dei dati, segmentazione semiautomatica può diventare una necessità. Nella Figura 5, i punti di forza e le limitazioni sono brevemente elencate per i quattro approcci di segmentazione. Gli obiettivi personali e le caratteristiche dell'immagine identificati nella Figura 4, che è possibile accoppiare ciascun approccio sono descritti come bene. Nella Figura 6, gli obiettivi personali e le caratteristiche di immagine dei sei set di dati esemplificano come triage dati e decidere l'approccio migliore. Entrambe le figure 5 e 6 sono espanse su nella discussione. Carico / 51.673 / 51673fig1highres.jpg "width =" 500px "/> Figura 1 Flusso di lavoro per la ricostruzione di immagini biologiche e l'analisi. Questa tabella fornisce una panoramica delle varie misure adottate per raccogliere ed elaborare le immagini raccolte da tomografia, focalizzato fascio di ioni SEM, e blocco faccia seriale SEM. Risultati della raccolta di dati grezzi in serie tilt 2D o sezioni seriali. Questi set di immagini 2D devono essere allineati e ricostruiti in 3D, poi filtrato al fine di ridurre il rumore e migliorare il contrasto delle caratteristiche di interesse. Infine, i dati possono essere segmentati e analizzati, che si traduce in un modello 3D. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2.. Esempi di flusso di lavoro per i diversi tipi di dati di tomografia e FIB-SEM Ogni fase del flusso di lavoro dopo la raccolta dei dati viene mostrato attraverso quattro set di dati (righe AD): resina incorporati tomografia macchiato di stereocilia sezione longitudinale, resina incastonato tomografia macchiato della parete cellulare vegetale cellulosa, FIB-SEM di seno mitocondri delle cellule epiteliali, e SBF-SEM di E. coli, batteri. Una fetta 2D attraverso i dati grezzi è mostrato nella colonna 1, e un'immagine dai dati dopo l'allineamento e la ricostruzione 3D comprende colonna 2 Le tecniche di filtraggio applicate nella colonna 3 sono i seguenti: filtro mediano (A3), filtro diffusore non anisotropi (B3), sfocatura gaussiana (C3), e il filtro imadjust di MATLAB (D3). Un esempio della migliore segmentazione per ogni record della superficie coltivata di interesse (colonna 4) i dati vengono visualizzati come il rendering 3D in colonna 5. bar Scala: A1-A3 = 200 nm, A4 = 150 nm, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm D4-D5 = 200 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3 Applicazione di quattro segmentazione si avvicina ai set di dati di esempio serie di dati Six esempio sono stati segmentati da tutti i quattro approcci:. Manuale generazione astratto modello, tracciamento manuale, segmentazione automatica basata densità, e segmentazione automatica su misura. Manuale di generazione del modello astratto è stato efficace per la resina incorporato tomografia macchiato di stereocilia (A), in quanto lo scopo era quello di creare un modello per scopi quantitativi piuttosto che per estrarre densità. Per la resina incorporato tomografia macchiato della parete cellulare vegetale (B), automatizzato segmentazione basata densità-zione è stato il metodo più efficace per estrarre rapidamente la cellulosa attraverso molte fette, dove i metodi manuali hanno preso molto più sforzo da solo un paio di fette di dati. Manuale di generazione del modello astratto generato terzina microtubuli nella tomografia macchiato di kinocilium (C), mentre altri metodi di segmentazione non hanno, ancora i due approcci automatizzati estratto le densità più rapidamente ed erano quindi preferito. A causa della forma dei mitocondri da FIB-SEM di cellule epiteliali mammarie (D), tracciamento manuale fornito il risultato più pulito, e la bassa densità di popolazione combinata con l'uso di metodi di interpolazione consentito per la segmentazione rapido. Dato il grande volume che doveva essere segmentato, su misura segmentazione automatizzata ha dimostrato di essere più efficace per segmentare i batteri dati SBF-SEM (E), ma entrambi gli approcci automatici erano comparabili. Anche se in termini di tempo, l'unico metodo per estrarre il FIB-SEM della membrana delle cellule epiteliali della mammella (F) era tracciamento manuale Scala Bars.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, bar = 500 nm. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura. Figura 4. caratteristiche di immagine Obiettivo e finalità personali soggettivi per triaging dei set di dati. Utilizzando esempi di set di dati le caratteristiche, i criteri sono proposti per informare una decisione che la segmentazione approccio da utilizzare per. Per quanto riguarda le caratteristiche oggettive, i dati possono di per sé un contrasto che è a basso, medio o alto (A1-A3), è sfocata o croccanti (B1-B2), distanziati o affollata (C1-C2), e hanno complessi o semplicemente caratteristiche organizzati (D1-D2). Obiettivi personali soggettivi includono l'o desiderato OBIETTIVO mira un modello semplificato o estrarre le densità esatte (E1-E2), individuando un foglio contorto, il volume contorto, o morfologia lineare la caratteristica di interesse (F1-F3), la scelta di un alta o bassa densità di popolazione della caratteristica di interesse (G1-G2), e decidere il trade-off tra alta fedeltà e alta di allocazione delle risorse per un ritorno diminuzione degli investimenti come il tempo (H1-H2) Scale Bars:. A1 = 50 nm, A2 = 1500 nm , A3 = 100 nm, B1 = 1500 nm, B2 = 200 nm, C1 = 100 nm, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, 100 nm = E1, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, G1 = 100 nm, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. px "/> Figura 5 Tabella comparativa delle caratteristiche dei dati e soggettiva mira appropriati per i diversi approcci di segmentazione. Questa tabella riassume i punti di forza ei limiti di ogni approccio di segmentazione. I criteri di Figura 4 possono aiutare a identificare quali dataset sono adatti per il quale metodo di segmentazione. Queste caratteristiche oggettive di immagini e finalità personali soggettive furono scelti per un uso ottimale di ogni approccio, ma diverse combinazioni possono ostacolare o aiutare l'efficacia della segmentazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6 Decisione diagramma di flusso per un efficiente tmatri- di segmentazione approcci per i set di dati con caratteristiche diverse. Sulla base delle caratteristiche evidenziate in figura 4, questo diagramma illustra quattro criteri che hanno contribuito maggiormente alla decisione finale sulla migliore strategia di segmentazione per ogni set di dati di Figura 3. Ciascun set di dati è colore codificato a seguire rapidamente le linee in grassetto rappresentano il processo decisionale primario, così come le linee tratteggiate che riflettono un percorso alternativo che può o non può comportare lo stesso approccio. I kinocilium, batteri, e set di dati della parete cellulare vegetale sono stati meglio segmentate con i due approcci automatizzati. Al contrario, i percorsi membrana cellulare e mitocondri portano sempre al tracciamento manuale per le loro caratteristiche difficili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.