De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho típica em microscopia electrónica de imagem 3D celular, incluindo a tomografia de electrões, FIB-SEM, e SBF-SEM. O fluxo de trabalho inclui a coleta de dados em bruto, alinhamento de dados e reconstrução em um volume 3D, redução de ruído através da filtração, e quando necessário, recorte para a região de interesse, a fim de maximizar a eficácia do software de segmentação escolhida. Esses dados pré-processados ​​está pronta para a extração de características / segmentação. A Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho dispostas na Figura 1 com quatro conjuntos diferentes de dados (que serão introduzidas mais abaixo), duas das quais são amostras embebidas em resina gravados por tomografia de electrões (Figuras 2A, 2B), com as outras duas, decorrentes da FIB -SEM e SBF-SEM, respectivamente (Figuras 2C e 2D). Imagens em Figura 2 coluna 1 são: a projeçãovisualizações (Figuras 2A1, 2B1) e imagens da superfície do bloco (Figuras 2C1, 2D1), respectivamente, que após o alinhamento e reconstrução são montados em um volume 3D. A coluna 2 mostra fatias através de tais volumes 3D, o qual após a filtragem (coluna 3) mostram uma significativa redução do ruído e, assim, muitas vezes aparecem mais nítido. Depois de selecionar e cortar o grande volume 3D para a região de interesse (coluna 4), renderings 3D de características segmentadas de interesse (coluna 5) podem ser obtidos e ainda inspecionado, codificados por cores e analisados ​​quantitativamente. Um total de seis conjuntos de dados 3D, cada um contendo uma pilha de imagens obtidas através de tomografia ou de elétrons (3 conjuntos de dados), FIB-SEM (2 conjuntos de dados), ou SBF-SEM (1 conjunto de dados) são utilizadas para comparar a forma como cada um quatro métodos de segmentação executar (Figura 3). Os conjuntos de dados provêm de uma variedade de diferentes projetos de pesquisa em laboratório e, assim, fornecer arconjunto easonably diversificado de conjuntos típicos de dados experimentais. Todos os conjuntos de dados foram examinados por quatro pesquisadores independentes, cada um dos quais está mais familiarizado com uma abordagem particular, e eles foram acusados ​​de fornecer o melhor resultado possível para cada um dos seis conjuntos de dados. Os conjuntos de dados são a partir de amostras da seguinte forma: 1 Números 3A1-3A5: alta pressão congelado, congelar-substituído e incorporado por resina pinto o cabelo da orelha interna estereocílios das células 31, 2. Figuras 3B1-3B5: maior congelado pressão, Freeze- substituído e parede celular vegetal embebido em resina (não publicado), 3. Figuras 3C1-3C5: alto congelado pressão, congelam-substituído e incorporado por resina cinocílio células ciliadas do ouvido interno (não publicado), 4. Figuras 3D1-3D5: alta pressão- congelado, e substituído por congelação de blocos embebidos em resina de mitocôndrias localizados em células das glândulas mamárias humanas epiteliais HMT-3522 S1 ácinos, que foram cultivadas em laminina extracelular ricomatriz ular 32,33, 5. Figuras 3E1-3E5: limite de membrana de células vizinhas do HMT: processado-bancada, blocos embebidos em resina de um sulfato redutor de biofilme bacteriano (manuscrito em preparação), e 6 Figuras 3F1-3F5 unstained -3522 S1 ácinos. Como pode ser visto a partir da Figura 3, as diferentes abordagens de segmentação pode levar a resultados semelhantes na maior parte para alguns tipos de conjuntos de dados, mas os resultados completamente diferentes para outros tipos de dados. Por exemplo, o conjunto de dados estereocílios das células ciliadas (Figura 3A) produz volumes de segmentação razoáveis ​​com as quatro abordagens, com o modelo abstraído Manual gerada por um usuário experiente de ser o mais claro de interpretar e medir. Neste caso, tal modelo permite medições rápidas de distâncias filamento de filamento, a contagem do número de links encontrados entre os filamentos alongados, bem como a determinação das partes em falta do mapa de densidade correspondentepara locais onde o espécime foi danificado durante a preparação da amostra 34. Essa informação é muito mais difícil de adquirir, usando as outras três abordagens de segmentação, embora a segmentação automatizada sob medida proporciona melhores resultados do limiar puramente baseado em densidade. Para a parede da célula da planta (Figura 3B), a geração modelo manual pareceu ser o mais eficaz na transmissão de uma sensação de ordem na parede da célula, que nenhuma das outras abordagens obter. No entanto, o modelo abstraído não captura a lotação dos objetos do conjunto de dados. Manualmente recursos de rastreamento de interesse parece dar um resultado melhor do que as abordagens baseadas em densidade ou forma-supervisionados. Por outro lado, o traçado manual é muito trabalhoso e identificando fronteiras dos recursos é um pouco subjetivo. Portanto, abordagens automatizadas podem ser preferidos para segmentar grandes volumes com um potencial trade-off entre precisão erecursos gastos na segmentação manual. Para o conjunto de dados cinocílio (Figura 3C), a geração do modelo abstracto Manual produz o resultado mais limpo e revela uma arquitectura inesperada de três microtúbulos no centro da cinocílio, um pormenor que é facilmente visível nas dados cortadas, mas perdido em todas as outras abordagens , presumivelmente devido à heterogeneidade manchar. No entanto, outras características potencialmente cruciais do mapa de densidade são perdidas na geração manual de um modelo abstrato. Isto é devido ao facto de a natureza subjectiva da formação modelo manual conduz a uma idealização de abstracção e a densidade real observada, e, por conseguinte, para uma interpretação subjectiva durante a formação do modelo. Assim, este exemplo demonstra muito bem como o manual de geração do modelo abstraído permite se concentrar em um aspecto específico do volume 3D. No entanto, a percepção seletiva e simplificação deixa de dar um relato completo de tudo o co proteínamplexes presentes no conjunto de dados. Portanto, se o objectivo é o de mostrar a complexidade dos dados, em seguida, uma for melhor servida com qualquer um dos outros três abordagens. No caso de a matriz-cultivadas glândula mamária ácinos 3D (Figura 3D), as mitocôndrias são segmentados de alto contraste de todos os quatro abordagens com facilidade, com o método manual de características não é muito surpreendente produzindo os melhores resultados com a menor quantidade de contaminação ( Figura 3D3). No entanto, o rastreamento manual é muito trabalhoso e, portanto, de uso limitado para grandes volumes. Ambos limiar baseado na densidade e segmentação automática supervisionada em forma de extrair as mitocôndrias muito bem, e resultaria em uma segmentação quase perfeito, se mais truques para limpeza são empregados (por exemplo, eliminando todos os objetos abaixo de um determinado limiar de densidade voxel) como disponível em diferentes pacotes. Neste caso, manual de construção modelo captada não deuresultados promissores, em parte porque a mitocôndria não pode facilmente ser aproximado com modelos de esfera e de vara. No que diz respeito ao solo comunidade bacteriana / biofilme (Figura 3E), três dos quatro abordagens deu resultados satisfatórios, com a geração modelo manual não realizando assim devido ao desafio de representar objectos biológicos, tais como as bactérias, por formas geométricas. Apêndices extracelular provenientes das bactérias podem ser detectadas nas abordagens de segmentação automatizados, mas não tão bem no traçado característica manual. Segmentação sob medida Forma-supervisionado automatizada pode separar ainda mais as características das bactérias extracelulares, apesar das suas densidades semelhantes (dados não mostrados), o que permite fácil quantificação do mesmo extremamente grandes conjuntos de dados. Porque este é originalmente um conjunto muito grande de dados, a segmentação automática sob medida claramente suplantado todas as outras abordagens, mas pode ter beneficiado da baixa complexidadeea distribuição relativamente escassa dos objetos de interesse (baixa lotação). Ao examinar a interface entre duas células eucarióticas num contexto de tecido semelhante (Figura 3F), apenas o método manual de características de interesse produzido bons resultados. Abordagens de segmentação baseada na densidade automatizados falhar na detecção do limite da membrana entre as células adjacentes no total, e até mesmo as abordagens sob medida falhar, em parte, porque a forma de uma célula não é facilmente aproximadamente equacionada ou com formas, apesar do sucesso evidente para as bactérias no biofilme (Figura 3E5). A observação da Figura 3 que as abordagens de segmentação fazem bem em alguns conjuntos de dados, mas não em outros levou à pergunta sobre o que caracteriza cada um destes conjuntos de dados, e se era possível categorizar os tipos de características de dados ou objectivos pessoais que pareciam combinar bem com seu respective abordagem. O estudo sistemático do tema não tenha sido previamente realizada, e, portanto, como um primeiro passo de um estabelecimento de uma lista empírica de características da imagem e os objetivos pessoais podem orientar um novato em sua tentativa de encontrar a melhor abordagem para extração de características de seus respectivos conjuntos de dados. Foram identificadas oito critérios como significativa são mostrados na Figura 4, e estes podem ser divididos em duas categorias principais: (1) as características que são inerentes ao conjunto de dados, e (2) os objectivos pessoais do investigador e outras considerações que são um pouco mais subjetiva, embora igualmente importante. Os exemplos apresentados são predominantemente extraídas dos seis conjuntos de dados na Figura 3, com três conjuntos adicionais de dados a ser introduzidos: um (Figura 4A1) é um crio-tomografia de uma crio-secção de parede celular de plantas de Arabidopsis thaliana, a segunda (Figuras 4A2 , 4B1, 4D1 </strong>) é um FIB / SEM conjunto de dados da estria vascular ouvido interno, que é um tecido altamente complexo e complicado que poderiam caber na categoria representada nas Figuras 3F1-3F5 mas é ainda mais complexo substancialmente, e o terceiro (Figuras 4b2 , 4D2) é uma secção de resina tomografia de estereocílios células ciliadas do ouvido interno, em vista em corte transversal, semelhante à da amostra mostrada na vista longitudinal em Figuress 2A1-2A5 e 3A1-3A5. Para a categoria dos critérios objectivos, como as características da imagem, quatro traços inerentes aos conjuntos de dados são propostos como sendo de importância: O contraste dos dados pode ser (1) baixa (Figura 4A1) como é típico para tomogramas crio-EM, (2) intermédio (Figura 4A2), tais como em cenários celulares sem organelo clara ou outra característica proeminente permanente, ou (3) de alta (Figura 4A3), como é o caso da kinocitomograma liary ou estereocílios na seção transversal, devido ao alinhamento de elementos filamentosos claramente separadas dentro da direção z. Os dados podem ser difusa (Figura 4B1), sem limites visivelmente claras entre dois objetos de perto posicionados, tais como as células em um tecido, ou batata frita (Figura 4B2), com fronteiras bem definidas. Isto é, em parte, uma função do conjunto de dados de resolução, que é inerentemente mais elevado por um factor de cerca de 2-4 por tomografias de electrões em relação ao FIB-SEM. Naturalmente, as fronteiras nítidas são desejáveis ​​tanto para manual, bem como abordagens de segmentação automática, mas essencial para a última abordagem. Os mapas de densidade pode ser lotado (Figura 4C1) como refletido pelos componentes da parede celular vegetal bem espaçadas, ou de baixa densidade populacional (Figura 4C2), assim como as bactérias em uma colônia, que exemplifica a separação que torna a segmentação automatizada imagem substancialmente mais fácil. Mapas de densidade pode ser altamente complexa, com características muito diferentes, muitas vezes, com formas irregulares, tais como tecido da estria vascular em torno de um vaso sanguíneo (Figura 4D1) ou organelos semelhantes a objectos bem definidos, com uma organização semelhante, tais como a secção transversal de estereocílios ( Figura 4D2). Observe também os muito diferentes escalas em todos os diferentes exemplos, tornando a comparação um pouco difícil. Para além dos critérios mais objetivos, como as características da imagem, quatro critérios altamente subjetivos que irão orientar a seleção do caminho adequado também são propostas: Objetivo pretendido: O objetivo pode ser o de visualizar o cabelo pacote stereocilium em sua complexidade e para determinar e examinar a forma do objeto (Figura 4E1), ou para criar um modelo de bola e vara simplificada e abstraída que está embutido no mapa de densidade e permite uma rápida uma contagemª medição dos objetos geométricos (comprimento de filamento, a distância eo número de conexões) (Figura 4E2). A morfologia característica pode ser altamente irregular e complexo, como as células, tais como as zonas de interacção célula-célula (figura 4F1), tanto em forma semelhante, com algumas variações, tais como as mitocôndrias (figura 4F2), ou na sua maioria em forma idêntica, tal como os filamentos de actina e transversal elos de uma madeixa de cabelo na orientação longitudinal (Figura 4F3). A proporção da característica de interesse (densidade populacional) é importante, pois pode-se querer segmento todos os recursos em um conjunto de dados 3D, como é o caso de paredes celulares das plantas (Figura 4G1), ou apenas uma pequena fração do volume celular como é o caso das mitocôndrias em uma cena celular heterogénea (Figura 4G2). Dependendo do tamanho do conjunto de dados e a percentagem de volume que requer uma segmentação, isto pode ser mais eficiente ao utilizarabordagens manuais. Em outros casos, tais como quando se está interessado em uma variedade de recursos, simplesmente não há alternativa ao uso de abordagens semi-automatizado de segmentação. Outro critério subjetivo fundamental é a quantidade de recursos se está disposto a investir no processo de segmentação e qual o nível de fidelidade é necessária para responder a uma questão biológica. Um pode querer e precisar para quantificar parâmetros volumétricos de um recurso (como tamanho, volume, área de superfície, comprimento, distância de outros recursos, etc), caso em que pode ser necessário mais cuidado para obter informações quantitativas precisas (Figura 4H1), ou o efeito pode ser o de simplesmente tirar uma foto de sua forma 3D (Figura 4H2). Em um mundo ideal, onde os recursos são ilimitados, uma claramente não gostaria de assumir nenhum compromisso, mas sim optar pelo caminho mais preciso de extração de características manual assistida por usuário. Embora isso possa funcionar para muitos conjuntos de dados, em um futuro próximo volumes 3D wil l ser da ordem de 10k por 10k por 10k ou superior e segmentação manual não será mais capaz de desempenhar um papel de destaque na segmentação de um enorme espaço. Dependendo da complexidade de dados e outras características dos dados, a segmentação de semi-automatizada pode tornar-se uma necessidade. Na Figura 5, os pontos fortes e as limitações são brevemente coletados para as quatro abordagens de segmentação. Os objetivos pessoais e características da imagem identificados na Figura 4, que pode emparelhar com cada abordagem são descritos também. Na Figura 6, os objetivos pessoais e características da imagem dos seis conjuntos de dados exemplificam como a triagem de dados e decidir sobre a melhor abordagem. Ambas as figuras 5 e 6 são expandidas na discussão. carga / 51673 / 51673fig1highres.jpg "width =" 500px "/> Figura 1 Fluxo de trabalho para a reconstrução de imagem biológica e análise. Este quadro dá uma visão geral dos vários passos dados para coletar e processar imagens recolhidas por tomografia, focada Ion Beam SEM, e serial bloco rosto SEM. Raw resultados de coleta de dados em série tilt 2D ou cortes seriados. Estes conjuntos de imagens 2D devem ser alinhadas e reconstruídos em 3D, em seguida, filtrada de modo a reduzir o ruído e para melhorar o contraste de características de interesse. Finalmente, os dados podem ser segmentados e analisados, resultando em um modelo 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2.. Exemplos de fluxo de trabalho para diferentes tipos de dados de tomografia e FIB-SEM Cada etapa do fluxo de trabalho após a coleta de dados é mostrado através de quatro conjuntos de dados (linhas AD): resina embutidos tomografia manchado de estereocílios seccionados longitudinalmente, resina incorporado tomografia manchado da parede celular vegetal celulose, FIB-SEM de mitocôndrias de células epiteliais da mama, e a SBF-SEM de E. coli bactérias. Uma fatia 2D através dos dados em bruto está indicado na coluna 1, e uma imagem a partir dos dados, após alinhamento e reconstrução 3D compreende coluna 2 As técnicas de filtragem aplicada na coluna 3, são os seguintes: filtro de mediana (A3), filtro de difusão não-anisotrópica (B3), Gaussian Blur (C3), e filtro imadjust do MATLAB (D3). Um exemplo do melhor segmentação para cada conjunto da área cultivada de juros (coluna 4) os dados são exibidos como renderizar um 3D na coluna 5. Barras de escala: A1-A3 = 200 nm, 150 nm = A4, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 Aplicação de quatro abordagens para a segmentação exemplo conjuntos de dados Seis exemplo conjuntos de dados foram segmentados por todas as quatro abordagens:. Geração manual de abstraída modelo, traçado manual automatizado de segmentação baseada em densidade e segmentação automatizada sob medida. A geração manual modelo abstraído foi eficaz para a resina incorporado tomografia manchado de estereocílios (A), como o objetivo era criar um modelo para fins quantitativos, em vez de extrair densidades. Para a resina incorporado tomografia manchado de parede celular vegetal (B), segmentadas automatizada baseada em densidadeção foi o método mais eficaz para extrair rapidamente a celulose através de muitas fatias, onde, como os métodos manuais levou muito mais esforço em apenas algumas fatias de dados. A geração manual modelo abstraído gerado o trio de microtúbulos na tomografia manchado de cinocílio (C), enquanto que outros métodos de segmentação não fez, no entanto, as duas abordagens automatizadas extraído das densidades mais rapidamente e, portanto, eram preferidos. Devido à forma de mitocôndrias de FIB-SEM de células epiteliais da mama (D), marcação manual, desde que o resultado mais limpo, e a baixa densidade populacional com o uso de métodos de interpolação são autorizadas para segmentação rápido. Dado o grande volume que precisa ser segmentada, a segmentação automática sob medida provou ser mais eficiente para segmentar os dados bactérias SBF-SEM (E), mas ambas as abordagens automáticas eram comparáveis. Apesar de demorado, o único método para extrair o FIB-SEM da membrana das células epiteliais da mama (F) foi traçado manual barras de escala.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, bares = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. características da imagem objetiva e objetivos pessoais subjetivas para triagem de conjuntos de dados. Usando exemplos do conjunto de dados características, os critérios são propostos para informar a decisão de qual abordagem de segmentação de usar. Com relação às características objectivas, os dados podem inerentemente têm contraste que é baixa, média ou alta (A1-A3), estar fora de foco ou batata frita (B1-B2), espaçadas ou lotado (C1-C2), e tem complexo ou simplesmente recursos organizados (D1-D2). Objetivos pessoais subjetivas incluem o desejado bjective destinada a um modelo simplificado ou extrair as densidades exactas (E1-E2), para identificar uma folha enrolada, o volume convoluta, ou morfologia linear como a característica de interesse (F1-F3), a escolha de uma alta ou baixa densidade populacional da característica de interesse (G1-G2), e decidir sobre o trade-off entre a alta fidelidade e alta de alocação de recursos para um retorno cada vez menor em investimentos, tais como o tempo (H1-H2) barras de escala.: A1 = 50 nm, A2 = 1500 nm , A3 = 100 nm, B1 = 1500 nm, B2 = 200 nm, 100 nm = C1, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, 100 nm = E1, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, 100 nm = G1, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. px "/> Figura 5 Tabela de comparação de características de dados e visa subjetiva apropriado para diferentes abordagens de segmentação. Esta tabela resume os pontos fortes e limitações de cada abordagem de segmentação. Os critérios de Figura 4 pode ajudar a identificar quais os conjuntos de dados são adequados para o método de segmentação. Estas características da imagem objetivos e metas pessoais subjetivas foram escolhidos para uso otimizado de cada abordagem, mas diferentes combinações podem impedir ou melhorar a eficácia da segmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 Decisão fluxograma para eficiente tcasa- de segmentação se aproxima para conjuntos de dados com características variadas. Baseado nas características em destaque na Figura 4, este diagrama mostra que quatro critérios a que mais contribuiu para a decisão final sobre a melhor abordagem de segmentação para cada conjunto de dados Figura 3. Cada conjunto de dados é codificados por cores para acompanhar rapidamente as linhas grossas representam o processo de tomada de decisão primária, bem como as linhas pontilhadas, que reflectem um caminho alternativo que pode ou não levar à mesma abordagem. Os cinocílio, bactérias e conjuntos de dados da parede celular vegetal foram mais segmentado, com as duas abordagens automatizadas. Em contraste, os caminhos da membrana celular e mitocôndrias sempre levar a cópia manual devido às suas características difíceis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.