من Voxels إلى المعرفة: دليل عملي للتجزئة مجمع المجهر الإلكتروني 3D-البيانات
Özet
عنق الزجاجة للالخلوي المجهر الإلكتروني 3D هو ميزة استخراج (تجزئة) في غاية التعقيد خرائط كثافة 3D. قمنا بتطوير مجموعة من المعايير، التي توفر توجيهات بشأن النهج الذي تجزئة (دليل، وشبه الآلي، أو الآلي) هو الانسب لأنواع مختلفة من البيانات، وبالتالي توفير نقطة انطلاق لتجزئة فعالة.
Abstract
وقد سمحت النهج الحديثة المجهر الإلكتروني 3D مؤخرا فكرة غير مسبوقة في المنظمة 3D التركيبية للخلايا والأنسجة، مما يمكن التصور من آلات الجزيئات الكبيرة مثل المجمعات الالتصاق، فضلا عن الهياكل العليا، مثل الهيكل الخلوي والعضيات الخلوية في حياتهم خلية منها والسياق الأنسجة. بالنظر إلى التعقيد الكامن من وحدات التخزين الخلوية، فمن الضروري لاستخراج أول ملامح الفائدة من أجل السماح التصور، الكمي، وبالتالي فهم تنظيم 3D بهم. يتم تعريف كل مجموعة من البيانات الخصائص المميزة، على سبيل المثال، نسبة، هشاشة (الحدة) إشارة إلى الضجيج للبيانات، عدم تجانس معالمه، زحام ميزات، وجود أو عدم وجود الأشكال المميزة التي تسمح لسهولة تحديد الهوية، ونسبة من حجم كامل أن منطقة محددة من الفائدة تحتل. لا بد من النظر في جميع هذه الخصائصعند اتخاذ قرار بشأن التي تقترب لاتخاذ لتجزئة.
مجموعات 3D مختلفة ستة البيانات التركيبية عرض تم الحصول عليها من قبل ثلاثة التصوير نهج مختلف: الراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير المقطعي الإلكترون الملون، ركز ايون beam- وكتلة تسلسلي المسح face- المجهر الإلكتروني (SEM-الاكذوبه، SBF-SEM) من عينات الملون والمعشق أقل ما يقال بشدة ، على التوالي. لهذه مجموعات البيانات، تم تطبيق أربعة نهج تجزئة مختلفة: (1) جاء اليدوي بالكامل بناء نموذج فقط من التصور للنموذج، (2) تتبع تجزئة اليدوي للبيانات تليها تقديم السطح، (3) نهج شبه الآلي جاءت قبل تقديم السطح، أو (4) الآلي خوارزميات تجزئة مصمم خصيصا تليها تقديم السطحية والتحليل الكمي. اعتمادا على مزيج من خصائص مجموعة البيانات، تبين أن عادة واحد من هذه الطرق الأربعة الفئوية يتفوق على الآخرين، ولكن اعتمادا على التسلسل الدقيق للمعايير، موقد يكون نهج إعادة من واحد ناجح. بناء على هذه المعطيات، فإننا نقترح مخطط الفرز أن يصنف كلا موضوعية خصائص مجموعة البيانات الشخصية ومعايير موضوعية لتحليل مجموعات البيانات المختلفة.
Introduction
تقليديا، والمجهر الإلكتروني تم تقسيم (EM) في حقل 1) فرع علم الأحياء الهيكلي باستخدام عالية وفائقة عالية الدقة TEM، جنبا إلى جنب مع البيانات عادة صريحة أو ضمنية في المتوسط للتحقيق في ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات مع تركيبة محددة وعادة ما يكون صغير الحجم نسبيا 1-4، و 2) فرع في التصوير الخلوي التي تصور المناظر الخلوية كامل 1،5،6. في حين أن فرع البيولوجيا البنيوية شهدت تطورا مذهلة على مدى العقود الأربعة الماضية، كان فرع بيولوجيا الخلايا يقتصر في معظمه على بعدين، في كثير من الأحيان على عينات أقل من أمثل الحفاظ عليها. فقط مع ظهور التصوير المقطعي الإلكترون في العقد الأخير لديه خلية التصوير التركيبية البيولوجي سعت إلى البعد الثالث 5،7، حيث بلغ متوسطها عادة لا يمكن إجراء مثل المناظر الخلوية، وبالتالي ملامح الفائدة، هي فريدة من نوعها عادة.
على الرغم من مشاهد تصور الخلوية وغالبا ما تكون مذهلة للعين، واستخراج كفاءة من السمات من الاهتمام والتحليل الكمي لاحق من هذه الكميات الخلوية معقدة للغاية تتخلف، وذلك جزئيا بسبب تكوين البروتين الدقيق هو عادة غير معروف، مما يجعل صعوبة في تفسير هذه الخلوية أحجام 3D. إلى هذا التاريخ، كثيرا ما يحتاج الأمر الخبرات البيولوجية واسعة من أجل تفسير tomograms المعقدة، أو حتى لتحديد المناطق الهامة والعناصر الأساسية في حجم 3D. نتيجة مضاعفات أخرى، تصور حجم 3D هو ملحوظ غير تافهة. يمكن اعتبار كميات من 3D وبالتالي تصور وأكوام من الصور 2D. تفتيش من قبل شريحة شريحة من الصور 2D متتابعة يقلل من تعقيد، ولكنه أيضا ميزة حدود استخراج وتحليل كمي وبالتالي إلى البعدين. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم الأجسام 3D، تصوير مجلدات 3D على أنه مجرد كومة من الطائرات متتالية يؤدي إلى غير مكتملة ومنظور مشوه د في نظام معين طبيعة 3D. تتطلب طرق بديلة من الفحص البصري إما جعل حجم أو تقديم السطح، والتي تعطى-طبيعة كثير من الأحيان كثيفة من حجم الخلوي يمكن أن يؤدي بسهولة إلى وجهة نظر عرقلة من الأشياء المتداخلة أو تطغى مستخدم تماما، مما يجعل من الصعب التفاعلية تجزئة اليدوية.
لمعالجة هذه الحواجز، ومجموعة متنوعة كبيرة من ميزة استخراج الآلي وقد تم تطوير (تجزئة) النهج التي عادة ما تكون إما density- أو 8-10 القائم على التدرج. ومع ذلك، هذه الأساليب تميل إلى شريحة وحدة التخزين بالكامل بغض النظر عن أي مناطق أو الميزات التي تهم الخبراء، على الرغم من أن بعض الطرق الحديثة يمكن أن تستهدف ميزة معينة من الاهتمام مثل خيوط الأكتين 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرامج المنفذة تجزئة الآلي يؤدي أحيانا في إنتاج عدد كبير من وحدات التخزين الفرعية (على سبيل المثال، عند تطبيق immersio مستجمعات المياهن تجزئة) التي تحتاج في كثير من الأحيان المراد دمجها يدويا مرة أخرى تضم ميزة كاملة من الفائدة أو أن تخضع لمزيد من التجزئة. هذا ينطبق بشكل خاص للمجموعات البيانات المعقدة والمزدحمة، مما جعل معظم خوارزميات الكمبيوتر غير قادرة على استخراج فقط ملامح المصالح مع الإخلاص، وجهود كرأيشن كبيرة من قبل خبير في كثير من الأحيان اللازمة لإنتاج حجم مجزأة المطلوب.
وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم نشر حلول مخصصة لمشكلة محددة للغاية كورقة اجتماع العلمية، مع قليل من دون التركيز على جعلها واسعة وشاملة الأدوات في متناول الباحثين الذين ليس لديهم معرفة وثيقة من مجالات الرياضيات وعلوم الكمبيوتر و / أو رسومات الحاسوب. وتخصيص بيئة البرمجيات والبرمجة، وتحتوي على مجموعة من المكتبات تحليل الصور، يمكن أن يكون مجموعة أداة قوية تتيح للمستخدمين إرسال وحدات خاصة بهم بكفاءة لتجزئة دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب تحويلةالتدريب ensive وخلفية في علوم الكمبيوتر من أجل الاستفادة من العديد من معالمه أو قدرات لتحليل الصور. يمكن للمرء أن يعمل ضمن هذه البيئة البرمجيات تنوعا لمجموعات بيانات معينة حيث الميزات هي أكثر متفرق، على سبيل المثال، من خلال استخدام النهج القائم على الشكل القوية التي تعتمد على الهندسة الفريدة "قوالب" لفصل الأشياء من الاهتمام من محيطهم 12،13 .
مجموعة متنوعة العادلة للحزم التصور رسومات الحاسوب التفاعلية موجودة لتجزئة اليدوية وبناء نموذج. بعض الحزم المتوفرة تجاريا، والبعض الآخر من أصل الأكاديمي وتوزيعه مجانا، مثل: جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو الوهم 14، جامعة كولورادو IMOD 15، وجامعة تكساس أوستن VolumeRover 16. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة وتعقيد ميزات وقدرات هذه البرامج تمتلك تفاقم حالة منحنى التعلم لعصامالفصل. توفر برامج التصور بعض نماذج هندسية بسيطة مثل الكرات والعصي من مختلف الأحجام، والتي يمكن وضعها في خرائط الكثافة من أجل خلق نموذج مبسط لحجم 3D المعقدة. هذه النماذج ثم تسمح قياسات هندسية والحجمي بسيطة وبالتالي تتجاوز مجرد "صورة جميلة". مثل هذا التعقب اليدوي للكائنات يعمل بشكل جيد للأحجام التي يحتاج فيها سوى عدد قليل من الكائنات التي سيتم تتبعها واستخراجها. ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة من الحجم الكبير التركيبية التصوير 3D باستخدام شعاع مركز أيون المجهر الإلكتروني (الاكذوبه-SEM) 17-20 أو كتلة التسلسلي المجهر الإلكتروني الماسح وجه (SBF-SEM) 21 يعرض مضاعفات إضافية أن حجم البيانات 3D يمكن للمجموعات تتراوح بين غيغابايت إلى عشرات ومئات غيغابايت، وحتى تيرابايت. لذلك، مثل هذه الكميات 3D كبيرة لا يمكن الوصول إليها عمليا ميزة استخراج اليدوي، وبالتالي كفاءة الفذ شبه الآلي الموجهة المستخدمسوف استخراج لدى عودتهم يكون واحدا من الاختناقات للتحليل الفعال للمجلدات 3D في المستقبل المنظور.
قدمت هنا هي أربعة نهج تجزئة المختلفة التي تستخدم بشكل روتيني على طائفة واسعة من أنواع الصور البيولوجية. هذه الأساليب ثم يتم مقارنة لفعاليتها لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات، والسماح لتجميعها في دليل لمساعدة علماء الأحياء تقرر ما يمكن أن يكون أفضل نهج تجزئة للميزة استخراج الفعال للبيانات الخاصة بهم. كما هي أدلة المستخدم بالتفصيل المتاحة لمعظم البرامج المذكورة، والهدف من ذلك هو عدم جعل المستخدمين المحتملين مألوفة مع أي من هذه الحزم معينة. بدلا من ذلك، فإن الهدف هو إظهار القوة والضعف لكل من هذه الاستراتيجيات تجزئة مختلفة من قبل تطبيقها على مجموعات البيانات ستة سبيل المثال ذات الخصائص المتنوعة. من خلال هذه المقارنة، تم وضع مجموعة من المعايير التي تستند إما على خصائص الصورة الموضوعية للمجموعات البيانات 3D، مثل تباين البيانات، هشاشة، الاكتظاظ، والتعقيد، أو تنبع من اعتبارات ذاتية، مثل الهدف المنشود للتجزئة، والأشكال التضاريسية من الميزات لتكون مجزأة، والكثافة السكانية من سمات الفائدة، وهذا يعني جزء من حجم المحتلة بواسطة ميزة المصالح، وكيف يمكن للمرء العائدات على النحو الأمثل مع الموارد المحدودة مثل الوقت وتوفر للموظفين. هذه مجموعات البيانات المختلفة المثال توضح كيف يمكن لهذه المعايير الموضوعية والذاتية بالتتابع تطبيقها في مجموعة متنوعة من التشكيلات لتسفر عن الاقتران بعض النهج مع ميزة استخراج أنواع معينة من مجموعات البيانات. التوصيات المقدمة سيساعد نأمل المبتدئين واجهت مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخيارات تجزئة اختيار النهج الأكثر فعالية لتجزئة حجم 3D الخاصة.
في حين أن التركيز في هذه الورقة هو ميزة استخراج، والانتباه إلى جمع البيانات وقبل تجهيز البيانات أمر بالغ الأهمية لكفاءة قegmentation. في كثير من الأحيان تلطيخ عينات يمكن أن يكون متساويا، وبالتالي، ينبغي النظر التحف تلطيخ المحتملة في إجراءات تجزئة. ومع ذلك، وصمة عار عادة يعطي أعلى إشارة إلى الضجيج، وبالتالي تتطلب أقل الترشيح وغيره من ضروب المعاملة الرياضية كميات الخلوية، والتي يحتمل أن يؤدي أيضا إلى التحف. مجموعات بيانات الصورة الخام منها تحتاج إلى الحصول عليها في إعدادات التباين وبيكسل الصحيحة، الانحياز، وأعيد بناؤها في حجم 3D. لtomograms، يتم بناؤها الصور الانحياز عادة ما تستخدم المرجحة الخلفية الإسقاط، ثم عادة ما تعرض مجموعة البيانات إلى خوارزميات مثل تقليل الضوضاء غير الخطية متباين الخواص نشر 22، 23 تصفية الثنائية، أو متوسط عودي تصفية 24. يتم محاذاة البيانات التصوير الاكذوبه-SEM وSBF-SEM بواسطة شرائح عبر ربط متتالية في برامج الاستفادة XY مثل يماغيج 25. تعزيز التباين وتصفية يمكن تطبيقها على تعزيز ملامحالفائدة وبالتالي لاجتثاث الضوضاء صورة المكدس. تصفية يمكن أن يؤديها إما على وحدة التخزين بالكامل قبل subvolume اختيار أو على subvolumes المختارة، مع اقتراب تصفية يمكن أن تكون مكلفة حسابيا. أسفل عينة من البيانات (binning)، والذي يستخدم في بعض الأحيان للحد من الضوضاء و / أو تخفيض حجم الملف، ويوصى فقط إذا كانت البيانات قد تم oversampled بشكل ملحوظ مقارنة مع القرار المتوقع.
بعد الحد من الضوضاء، والصور يمكن بعد ذلك معالجتها مجزأة بطرق مختلفة، والتركيز في هذه الدراسة على الأربعة التالية: (1) نموذج الجيل اليدوي المستخرجة من خلال خلق نموذج الكرة والعصا، (2) تتبع اليدوي من الميزات المصالح، (3) الكثافة الآلي القائم على عتبة، و (4) بمواصفات محددة تجزئة الآلي عبر برنامج نصي للتجزئة محددة المشروع. تجزئة حدود 8 و 10 تجزئة غامرة مستجمعات المياه هي بدائل أفضل لالعتبة بسيطة، ولكن ريا تنتمي في نفس الفئة والتي لم تدرج صراحة في هذه المناقشة.
تتبع اليدوي للكثافة يتطلب تحدد ملامح الفائدة، شريحة تلو شريحة، والذي يسمح الإبقاء على الكثافة الأصلية للمناطق الفرعية الخلوية منها. هذا النهج يتيح السيطرة القصوى من عملية تجزئة، بل هي عملية شاقة وكثيفة العمالة.
النهج كثافة تجزئة الآلي (وذات الصلة) القائم على عتبة هي نصف آلية، حيث تختار خوارزمية بكسل استنادا إلى مجموعة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم. هي عدة الأكاديمية (مجاني) حزم التصور، مثل UCSF الوهم، IMOD، فيجي 26، وVolumeRover المتاحة، وكذلك التجارية (التي تتطلب تراخيص المدفوعة) حزم، وعادة ما تشمل كلا النوعين واحد أو أكثر من هذه الطرق تجزئة. وتشمل حزم البرمجيات المستخدمة في هذا العمل لتوضيح هذه الأساليب المختلفة كلا البرنامجين التجارية وق الأكاديمية المفتوحةource برامج لتوليد نموذج مجردة، وكذلك اليدوي والآلي كثافة تجزئة يدويا. ومع ذلك، يمكن للبرمجيات المصدر المفتوح في بعض الأحيان تقديم خيارات أكثر تقدما من خلال إمكانية التخصيص.
وأدت المقارنة بين هذه التقنيات باستخدام أنواع مختلفة من مجموعات البيانات إلى العرض التالية من القواعد والتوجيهات بشأن كيفية التعامل مع تجزئة كميات متنوعة 3D البيانات البيولوجية، والتي على حد علمنا لم يتم نشرها. وهكذا، وهذا هو المقارنة المنهجية الأولى من المناهج المختلفة وفائدتها على مجموعات البيانات ذات خصائص مختلفة بالنسبة للمستخدمين مع أهداف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات فعالة لاستخراج كميات من الميزات ذات الصلة 3D EM من أجل مواكبة البيانات تسونامي التي ضربت مؤخرا التصوير البيولوجي. في حين أن البيانات يمكن أن تتولد في ساعات أو أيام، فإنه يأخذ عدة أشهر لتحليل حجم 3D في العمق. وبالتالي، فمن الواضح أن تحليل الصور أصبح عنق الزجاجة للاكتشافات العلمية؛ دون حلول مناسبة لهذه المشاكل، والعلماء التصوير تصبح ضحايا نجاحهم الخاص. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد عالية للبيانات وأيضا الزحام الجزيئات التي توجد عادة في الخلايا البيولوجية، حيث تظهر البروتينات والمجمعات بروتين واحد آخر الحدود وأساسا والتدرج المستمر للكثافة الرمادي. ومما يعقد المشكلة عن طريق إعداد العينات والتصوير عيوب، وفي بعض الحالات إعادة الإعمار التحف الصورة، مما يؤدي إلى أقل من الكمال البيانات الحجمية التي يمكن أن تشكل تحديات لنهج مؤتمتة بالكاملوفاق. أهم، ومع ذلك، هو حقيقة أن الخبراء في إعداد العينات، والتصوير، والتفسير البيولوجي نادرا ما ضليعا في العلوم الحسابية، وبالتالي تتطلب توجيهات بشأن كيفية التعامل بشكل فعال ميزة استخراج وتحليل. لذلك، من خلال استخدام الأمثلة المختلفة، ويوضح البروتوكول كيفية تحضير البيانات للتجزئة، فضلا عن الخطوات اليدوي للجيل المستخرجة النموذج الآلي تجزئة القائم على الكثافة، تتبع اليدوي لملامح الفائدة، ومصممة خصيصا تجزئة الآلي. النهج اليدوي والآلي المبين في الإجراء يمكن العثور عليها في مجموعة كبيرة ومتنوعة من البرامج تجزئة، بعضها مذكور هنا، ولكن الآخرين أداء وظائف مماثلة وبنفس القدر مناسبة تماما.
وتظهر النتائج أن فعالية كل من النهج تجزئة 3D تختلف لكل نوع مختلف من مجموعات البيانات. على الرغم من أن نهج مختلفة نوعيا أنتجت قالاداءات 3D imilar والمنتج النهائي، ومقدار الوقت والجهد المبذول في كل أثناء عملية تجزئة تفاوتت بشكل كبير. وتتلخص التوصيات المناسبة لخصائص الصورة والأهداف الشخصية في نهج تجزئة في الشكل 5، الذي هو مزيد من شرح في الأقسام الفرعية الأربعة التالية. طبقت هذه المعايير إلى ست مجموعات البيانات، كما هو مبين في الرسم البياني قرار الشكل 6. على الرغم من أن الأرقام 5 و 6 هي مجرد تهدف إلى توفير الأساس المنطقي لكل مجموعة البيانات وكيفية ترجيح كل من المعايير في عملية صنع القرار، أنها لا توفر التوجيه مضمونة، وإنما هي نقطة البداية. هناك ببساطة الكثير من المعايير التي تؤثر في عملية صنع القرار: بعضها معايير موضوعية، مثل مجموعة بيانات الخصائص، بينما البعض الآخر معايير أكثر موضوعية، مثل الهدف المنشود. فمن المأمون القول أن مجموعات البيانات التي تعرض ليف عاليةش من النقيض مع حدود واضحة حادة، ولها الميزات التي يتم فصلها بشكل جيد ومتجانس نسبيا (وليس تنوعا جدا)، ويتم معالجتها بهدف عرض نموذج الكثافة لعدد كبير من الكائنات، فإن النهج الآلي تكون متفوقة، إن لم يكن ل حقيقة أن النهج اليدوية ببساطة أن تكون الموارد (الوقت) -prohibitive. من ناحية أخرى، إذا النقيض منخفضة، البيانات هو غامض وبالتالي يتطلب معرفة خبير، والكائنات هي مزدحمة، وتظهر ملامح تنوع كبير وبالتالي فهي غير متجانسة، واحد قد لا يكون لديك أي خيار آخر سوى ميزة استخراج دليل / تجزئة.
دليل ملخصات الجيل نموذج
اليدوي تتبع نموذج المستخرجة غير فعالة بشكل خاص في بتجزئة العناصر الخطية، وتوفير البذور نقطة (كرات) التي يمكن توصيلها (العصي) تلقائيا. هذه الكرات والعصي نماذج يمكن أن تكون قوية جدا لقياس طول والتوجه الثاني من هذا النموذج وتقديم نموذج المستخرجة بشكل كاف لكلا التفتيش النوعي والتحليل الكمي. الجيل اليدوي نموذج المستخرجة يستخدم عادة عند تقليل الموارد المنفقة على تحليل أكثر أهمية من الإخلاص المطلق لأشكال البيانات الأصلية. ومن أنجح مع ميزات والخطية المتجانسة من الفائدة (على سبيل المثال، خيوط وأنابيب). تباين البيانات، هشاشة، وزحام لا تلعب دورا رئيسيا في تحديد نجاح هذه الطريقة، وطالما أن العين البشرية يمكن التعرف على موضع اهتمام. في بعض الأحيان يمكن أيضا أن تستخدم مثل هذه النماذج على أنها هيكل عظمي لقطاع خريطة 3D في المنطقة حول الهيكل العظمي. على الرغم من أن النموذج المجرد بدلا من التفكير من الكثافة بالضبط، لأنها تمثل نسخة هيكل عظمي لكثافة 3D، وبالتالي يسمح لتصور خالية من الفوضى والتحليل النوعي. ويمكن أيضا القياسات الكمية مثل الطول يتحدد من نموذج تقريبي. لمثال على البرمجيات مع دليل نموذج الجيل المستخرجة، يرجى زيارة دليل المستخدم الوهم المفصل على الانترنت في http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .
بحث عن المفقودين اليدوي لملامح الفائدة
تتبع الفرشاة اليدوية يعمل بشكل جيد مع خصائص البيانات كلها تقريبا، ولكنها أيضا معظم الوقت طريقة طويلا. في بعض الأحيان، هو التقنية الوحيدة لاستخراج سمة من سمات الفائدة من مجموعة صورة معقدة تحتوي على مجموعة كبيرة من الميزات، مثل غشاء الخلية رقيقة ومعقدة. واحد أداة مفيدة المتوفرة في بعض البرامج تسمح الاستيفاء بين شرائح مجزأة بشكل متقطع عند ميزة الفائدة تتغير على نحو سلس. تتبع اليدوي يمكن تطبيق أكثر كفاءة إذا كانت البيانات هو هش ولديه متوسطة إلى عالية التباين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدملمجموعات البيانات أكثر صعوبة، طالما المستخدم على دراية موضع اهتمام. تعقيد البيانات يمكن أن تتراوح من كائنات منفصلة لمجموعات البيانات المعقدة والمزدحمة، حيث يتم معبأة بشكل وثيق الكائنات. في الحالة الأخيرة، قد يكون تجزئة اليدوية الخيار الوحيد، مع اقتراب التلقائي في كثير من الأحيان صعوبة في جزء من حجم المطلوب واستخراج أكثر من اللازم أو أقل من اللازم. ميزة الأشكال التضاريسية الصعبة، مثل ورقة الملتوية أو وحدات التخزين، كما يمكن استخراجها بواسطة هذا الأسلوب. ومع ذلك، يجب على المستخدم أن نضع في اعتبارنا أن مجموعة بيانات مع العديد من الخصائص صعبة لا يمكن مجزأة إذا كانت الكثافة السكانية من سمات الفائدة منخفضة، وتقسيم الكثافة السكانية العالية من سمات الفائدة تصبح زمنيا باهظة. للحصول على مثال البرمجيات مع تتبع اليدوي، يرجى زيارة دليل المستخدم أميرة مفصل على الانترنت في http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.
الآلي الإنقسام القائم على الكثافة
على النقيض من التقنيات اليدوية، والنهج الآلي عادة ما تكون أقل استهلاكا للوقت، وهو عامل مهم في الاعتبار عند تجزئة كومة كبيرة من الصور. ومع ذلك، العتبة بسيطة قد لا تكون دقيقة، وأكثر من الوقت يمكن أن تنفق على تحسين وكرأيشن من حجم مجزأة تلقائيا. تجزئة الآلي القائم على كثافة يعمل بشكل أفضل على مجموعات البيانات التي تعرض عدد كبير من ميزات مشابهة من الفائدة التي تتطلب كل تجزئة. إذا كانت البيانات أكثر تعقيدا، يمكن لهذه التقنيات الآلية لا تزال بمثابة الخطوة الأولى، ولكن من المرجح أن تتطلب بعض التدخل اليدوي أسفل الخط من أجل تحديد subvolume تحتوي على سمة من سمات الفائدة. هذه الاستراتيجية عادة ما يعمل بشكل جيد على الأشكال التضاريسية الخطية أو وحدات التخزين معقدة، لكنها نادرا ما ناجحة مع ورقة الملتوية رقيقة مثلأغشية الخلايا. تدخل المستخدم مع الحد الأدنى من النهج الآلي يمكن تجزئة من خلال كميات كبيرة أو صغيرة، في حين أن إنفاق الموارد القليلة المستخدم مثل الوقت في مقابل عالية الدقة. للحصول على مثال البرمجيات مع تجزئة الآلي القائم على الكثافة، يرجى زيارة دليل المستخدم أميرة مفصل على الانترنت في http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .
مصممة خصيصا الآلي الإنقسام
مصممة خصيصا تجزئة الآلي تسمح التخصيص قوة خوارزميات لمجموعة بيانات محددة، ولكن غالبا ما يكون محدد لمجموعة البيانات أو نوع البيانات، مناسبة لعدد محدود من الخصائص الميزة، ولا يمكن تعميمها بسهولة. الإجراء عرضت هنا يختلف عن النهج العامة تجزئة الآلي، مثل غمر المياه ومستوى آخر طرق مجموعة، والتي تعتمد على تقرير المبرمج للنقاط الحرجة البذور، تليها التوسع مكعب يسيرون بسرعة من هذه النقاط البذور. وهناك تباين حول هذا الموضوع هو تقسيم الحدود، حيث بإبلاغ المعلومات متجه الانحدار حدود الميزة. في المقابل، فإن السيناريو مخصصة المستخدمة هنا يعتمد على مرحلة التدريب حيث أن المستخدم يتتبع بعض الأمثلة يدويا. من خلال التعلم الآلي، وخوارزميات محددة كشف وثم تعلم كيفية التعرف بشكل مستقل خصائص وخصائص البيانات الموجودة باستمرار في آثار. مستخدم خبير يمكن إعادة تدريب خوارزميات وتحسين دقة تجزئة من قبل بما في ذلك المزيد من يتتبع سبيل المثال لتوفير مجموعة أكبر من المعايير الميزة. وعموما، قد لا تكون العتبة النهج والنهج ذات الصلة، أو حتى بمواصفات محددة ومفيدة لاستخراج سمة واحدة من الاهتمام من صورة مع التنوع معقدة من العضيات أو الأشكال، كما كرأيشن قد يكون تماما كما كثيفة العمالة كما تتبع اليدوي.
">استراتيجيات لTriaging البيانات واختيار نهج الإنقسام
نظرا لمعايير ذاتية وموضوعية المعروضة في الشكل 4 وملخص قواعد البيانات المناسبة في الشكل 5، مخطط صنع القرار مبين في الشكل (6) يمكن أن تساعد على تقييم فعالية استراتيجيات ميزة استخراج لمجموعة كبيرة ومتنوعة من مجموعات البيانات. وtriaged مجموعات البيانات في أربعة قرارات متتالية، كل منها يمكن أن تشمل أي واحد من كل أربعة أهداف فضلا عن معايير ذاتية أربعة أدخلت في الشكل 4. وكمثال على ذلك، الشكل 6 هو عقلاني للtriaging كل البيانات ستة مجموعات مبين في الشكل 3. مما لا شك فيه، لتضع كل البيانات ليس هناك مسار واحد فريد من نوعه، ولكن بدلا مسارات مختلفة من خلال هذه المصفوفة التالية معايير مختلفة لاتخاذ القرارات التي قد تؤدي رس نفس أو مختلفة توصية لتجزئة البيانات. في حين أن كل مجموعة البيانات سيكون لها مجموعتها الخاصة من الخصائص، التي لا يمكن توقعها، يتم إعطاء أمثلة ستة، كل يقترن مع شرح الأساس المنطقي وراء ميزة يفضل النهج استخراج / تجزئة. تشمل معظم أيضا اقتراحا لقرار طريق بديل إما أن النتائج في استخدام نفس أو نهج تجزئة مختلفة (الشكل 6).
والهدب المحرك هو هش البيانات التي تم تحديدها مع حدود واضحة المعالم، الأمر الذي يجعل من المرجح النهج الآلي لتحقيق النجاح. جميع الميزات التي تهم يتم فصل جيدا، لصالح مرة أخرى نهجا الآلي. بالإضافة إلى ذلك، ملامح الفائدة مشابهة لبعضها البعض، مما يجعلها مثالية متجانسة نسبيا مجموعة البيانات للبمواصفات محددة تجزئة. وأخيرا، كان الهدف لاستخراج ميزة بأكملها، لصالح نهج شبه الآلي. ونتيجة لذلك، فقد خلص إلى أن العتبة الآلي (الخط الأخضر الصلبة) وكذلك (على سبيل المثال، تشكل تجزئة أشرف) نهج مصمم خصيصا (الخط الأخضر منقط) من المرجح أن تفعل جيدا على هذا مجموعة البيانات على حد سواء.
معايير مماثلة، على الرغم من وضعها في ترتيب مختلف في الشبكة اتخاذ القرار، تنطبق على حالة البكتيريا. ينصح نهج بمواصفات محددة وذلك جزئيا بسبب هذا مجموعة البيانات كان كبير جدا. وبالتالي، تحظر الموارد المحدودة لنهج التدخل اليدوي / تجزئة كثيفة العمالة. بينما العتبة قد أسفرت عن نتائج مقبولة، وكان نهج مصمم خصيصا قادرة على تنفيذ الهدف الرئيسي للدراسة لفصل الأشكال البكتيرية مدور من الودائع المعدنية خارج الخلية، وتقع إما في الفترات الفاصلة بين البكتيريا أو بجوار البكتيريا، وبالتالي فإن كان يفضل النهج بمواصفات محددة.
لمجموعات البيانات أهداب ساكنة، وكان الاعتبار الأول الهدف المنشود: أن الهدف إما أن يكون لإظهار كثافة كاملأو لخلق نماذج هندسية. بلغ حجم الفائدة منطقة مزدحمة، وكان الهدف هو جزء من عدد كبير من الكائنات ككائنات فصل من أجل تنفيذ التحليل الكمي الحجمي، بما في ذلك أطوال والأرقام والمسافات، والتوجه، وما كان من المفيد في وقت لاحق أن كائنات الفائدة كانت الخطية أساسا، وهذا جعل نموذج هندسي تتبع الأسلوب المفضل. ومع ذلك، إذا كان بدلا من ذلك الهدف لإظهار كثافة بأكملها، ثم التشكل ميزة الخطي وكذلك التباين العالي نسبيا مع حدود محددة بشكل حاد من شأنها أن تجعل بروتوكول العتبة الآلي ممكنا.
أغشية الخلية والحالات البيانات الميتوكوندريا تشكل تحديا للنهج الآلي بسبب فئاتهم من ميزة التشكل: صفائح وأحجام الملتوية، على التوالي. كان الهدف هو تتبع خلية أو الميتوكوندريا مخطط بدقة، ولكن هناك موارد محدودة فقط للقيام بذلك. بالإضافة إلى ذلك، ملامح مشتركةطبقا لتقديرات معقدة ولا يمكن بسهولة الكشف عن شكل أو المشفرة تلقائيا، على الرغم من أن لمجموعات البيانات الميتوكوندريا نهج البرمجة المخصصة المتخذة للبكتيريا وقد يتم تطبيقها مع مزيد من التخصيص. لحسن الحظ، وغشاء الميتوكوندريا أنفسهم لا تمثل سوى جزء صغير من وحدة التخزين بالكامل، وبالتالي، تتبع اليدوي هو واضحة وإن كان نهج تستغرق وقتا طويلا. تتبع اليدوي هو أيضا الأسلوب المفضل لمثل هذه مجموعات البيانات عندما يكون التباين منخفض نوعا ما، والحدود وغامض إلى حد ما. ونتيجة لذلك، حتى لو كانت تشكل جزء كبير من مجموعات البيانات، هذه ورقة الملتوية يجب أن تتبع يدويا، وذلك ببساطة بسبب عدم وجود بديل أفضل.
مجموعة البيانات النبات يشكل تحديات خاصة بها لأن الهدف هو شريحة كافة الكائنات، التي هي كثيفة متباعدة وتشكل مشهد مزدحم. عرض كثافة كما هو شأنها تمكين قياسات حول شكل وتنظيم الكائنات، ولكن بecause بتجزئة يدويا ومكلفة للغاية، كان يعمل العتبة التلقائي كل كائن الخيطية بدلا من ذلك.
تم عرض مختلف الخطوات والنتائج المقابلة في خلق نموذج 3D هنا، ولكن الأهم من ذلك، وخصائص ومعايير البيانات الشخصية التي وجدت لتكون حاسمة في تحديد كما تم توضيح أفضل مسار للتجزئة. تشمل الخصائص المهمة للبيانات الصورة نفسها ما يوصف هنا المقابل، الاكتظاظ، هشاشة، وعدد من الأشكال أو الخصائص (مثل العضيات، خيوط، الأغشية) مختلفة. معايير ذاتية لتشمل النظر في الهدف المنشود من تجزئة (قياس / العد، تمثيل هيكل عظمي البيانات / عرض مجلدات في الاداءات 3D)، والخصائص المورفولوجية من ميزة الفائدة (خطي، ممدود، الشبكات، معقدة، معقد)، وكثافة ملامح الفائدة بالنسبة لحجم كامل (جزء من الكائنات التي هيحاجة مهمة واستخراجها)، وموازنة المبادلات من إنفاق الموارد على الإخلاص تجزئة للبيانات الأصلي وعودة على خفض الاستثمار مما أدى إلى تحسينات تدريجية لتخصيص أعلى بكثير من الموارد.
مجال تجزئة الصورة قد نضجت بشكل كبير خلال السنوات الأخيرة، وحتى الآن لا يوجد حل سحري، لا خوارزمية أو البرنامج الذي يمكن أن تفعل كل شيء. نمت أحجام مجموعة بيانات من مئات ميغابايت إلى عادة عشرات غيغابايت، وأنهم بدأوا الآن أن يتجاوز تيرابايت، مما يجعل التقسيم اليدوي شبه مستحيل. وبالتالي، لا بد من استثمارها في النهج ميزة استخراج ذكية وفعالة في الوقت التي تحاكي عملية صنع القرار المزيد من الموارد البشرية. سوف تحتاج هذه الجهود لتكون مجتمعة مع (1) نظام المعلومات الجغرافية (GIS) ومقرها قواعد البيانات الهرمية الدلالية (مماثلة لجوجل الأرض)، (2) تقنيات تجريد البيانات (أي الانتقالمن فوكسل لتمثيل هندسي / الحجمي) متوافق مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات من أجل خفض كبير في كمية البيانات وبالتالي تمكين عرض كميات أكبر 35، (3) تقنيات المحاكاة، لأنها كثيرا ما تستخدم في التخصصات الهندسية، فضلا عن (4) الرسوم المتحركة المتطورة وقدرات صنع الفيلم، بما في ذلك الرسوم المتحركة من خلال ذبابة (على غرار ما تم تطويرها لصناعة الألعاب).
بشكل واضح وفعال ميزة استخراج وتجزئة يكمن في قلب هذه الثورة القادمة في الخلوي التصوير ذات الدقة العالية، وبينما سوف يكون دائما حاجة إلى اتباع نهج أفضل، مبادئ قدمت هنا، وكذلك أمثلة على ما اتخذ نهج لأنواع البيانات المختلفة ، وسوف توفر بعض المعلومات القيمة لاتخاذ قرار بشأن النهج الذي لاتخاذ.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at University of California Berkeley for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article.
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.
Materials
| Material Name | Company | Yorumlar | |
| Amira | FEI Visualization Sciences Group | http://www.vsg3d.com/amira/overview | |
| Chimera | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| Photoshop | Adobe | http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html | |
| MATLAB | MathWorks | http://www.mathworks.com/ | |
| VLFeat | VLFeat | http://www.vlfeat.org/ |
Referanslar
- Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
- Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
- Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
- Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
- Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
- Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
- Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
- Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
- Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
- Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
- Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
- Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
- Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
- Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
- Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
- Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- MathWorks. . MATLAB. , (2012).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
- Vedaldi, A., Fulkerson, B. . VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
- Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons?. International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
- Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
- Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
- Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).
