전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em> 현장에서</em> 하이브리드
Özet
제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
제브라 피쉬 배아는 이제 일반적으로 발달 과정의 유전자 제어를 조사하고 선천성 이상을 모델로 기본 및 생물 의학 연구에 사용됩니다. 인생의 첫 번째 날 동안, 제브라 피쉬 배아는 수정, 절단, 낭 배기, 분할, 이러한 신장, 심장, 중추 신경계와 같은 구조의 기관 형성 등 많은 발달 단계를 통해 진행됩니다. 배아 라운드 노른자 질량과 공동으로 개발하고 있기 때문에 젊은 제브라 피쉬 배아의 해부학은 이러한 이벤트의 많은 관련된 조직의 시각화 및 분석을위한 몇 가지 과제를 제시한다. 따라서, 정확한 분석 및 tailbud 20 체절 단계와 같은 사용하여 염색 된 것과 같은 (각각 10, 19 시간 포스트 수정 (HPF),) 사이의 고정 된 배아 표본 실험 표현형의 이미징 전체는, 현장 하이브리드 (WISH)에 탑재 노른자 B에서 배아를 제거하는 것이 바람직하다모두와 유리 슬라이드에 평면을 배치합니다. 그러나, 편평한 마운트 절차를 수행하는 단계 지루한 일 수있다. 따라서, 평면 성공적이고 효율적인는 준비가 크게 절개 기법의 시각적 데모를 통해 용이하게 장착하고, 또한 최적의 조직 처리를 보조 시약을 사용하여 도움을 주었다. 여기서, 우리는 제브라 피쉬 배아에서 유전자 발현 중 하나 또는 두 가지 색 검출을 위해 우리 WISH 프로토콜을 제공하고, 평면 실장 절차 더러워 고정 표본이 예에서 수행 될 수있는 방법을 보여준다. 이 평면 장착 프로토콜은 초기 제브라 피쉬의 개발 과정에서 나오는 많은 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하며, 고정 된 배아 샘플에서 수행 다른 염색 방법과 함께 구현 될 수있다.
Introduction
제브라 피쉬, 다니오 rerio는 발달 생물학의 연구에 널리 사용되는 생물이되고있다. 제브라 피쉬는 가족 Cyprinidae에 속하는 열대 담수 척추 동물 종이다. 그들은 쉽게 얻을 저렴하고, 하나를 유지하기 쉽다 있었던 것에 지브라 피쉬는 원래 전위 수질 오염의 위험에 대한 정보를 얻기 위해 환경 연구에 사용 하였다. 지난 30 년 동안, 제브라 피쉬는 이유로 호스트에 대한 유전자 다루기 쉬운 척추 동물 모델 시스템으로 인식되고있다. 제브라 피쉬는 포유 동물 2,3 고등 척추 동물과 해부학 및 생리 학적 보존의 높은 수준을 보여줍니다. 최근 게놈 서열 주석 인간 유전자의 약 70 %가 적어도 하나의 제브라 피쉬의 대응 4이 있다고 밝혔다. 예를 들어, 신장 개발 과정에서 중요한 역할을 많은 orthologous 유전자는이 종의 5 ~ 7 사이에 확인되었습니다. 이 드라세포 및 분자 생물학 관련하여 보존 매틱 정도는 제브라 피쉬 8 인간의 질병의 다양한 모델을 만들 연구자 사용할 수 있으며, 제브라 피쉬 화학 유전 스크린 (9)를 이용하여 잠재적 인 약물 요법을 식별하기위한 유용한 도구가되었다.
또한, 제브라 피쉬 모델뿐만 아니라 복잡한 발달 과정과 인간에서 볼 수 있습니다 다양한 질환을 요점을 되풀이하지만, 몇 가지 추가 속성도 함께 배아 연구를위한 모델 생물로의 매력을 높일 수 있습니다. 제브라 피쉬는 난생하고 수정 (10)의 시작에서 태아에 쉽게 접근 할 수있는 연구자를 제공하는 방송 산란을 통해 재현하고 있습니다. 다른 장점은 태아의 크기, 투명도 및 빠른, 외부 개발 (10)이 (가) 있습니다. 또한, 제브라 피쉬의 성인은 높은 생산력을 가지고 일반적으로 200 ~ 500 사이의 범위는 상대적으로 큰 클러치 크기를 생산일주일, 궁극적으로 쉽게 9 이러한 표현형 기반 화학 화면으로 높은 처리량 실험을 수행 할 연구원을 가능하게한다.
그럼에도 불구하고, 제브라 피쉬 모델에 의해 전시되는 장점의 과다에도 불구하고, 분석 및 초기 개발 단계에서 얻은 실험 결과의 통신과 관련된 문제가 있습니다. 어떤 경우에는, 제브라 피쉬 배아의 고유 해부학 하나의 데이터의 시각화를 모호 있었다. 발달이 진행됨에 따라 (11)을 수정 한 후, 초기 셀은 여러 분열 이벤트를 겪는다. 낭 배기 후, 배아 축이 노른자 11 감싸되도록 tailbud 단계 (10 HPF)에서 나온다. 이후의 개발은 분할 기간을 통해 진행되는 트렁크 대량으로 성장하고 또한 축 방향으로 길게 연장되는 노른자의 일부와 함께 꼬리 자체 골목 중앙 노른자 질량에서, 연장하도록11. tailbud 20 체절 단계 (19 HPF) 사이에, 같은 WISH 등 다양한 염색 프로토콜의 이용 후 특정 발달 기능을 관찰하기 위해 시도, 모두에 의한의 배아 및 불투명도의 형상을 시각화하고 사진에 도전 할 수있다 난황. 이러한 문제를 해소하기위한 한 가지 방법은 노른자를 제거하고 더 간단한 방식으로 분석 할 수있는 이차원 샘플로 배아를 평탄화하는 것이다.
다음과 같은 프로토콜 및 비디오 자원이 성공적으로 deyolk 및 평면 하나 또는 두 개의 컬러 WISH 염색의 예를 사용하여, 고정 및 염색 다음 배아를 마운트하는 방법에 대한 가이드를 제공합니다. WISH 보존 시료에서 특정 핵산의 검출을 가능하게하고, 따라서 조직 내에서 검출되는 유전자 발현의 사이트 (들)을 허용 널리 사용되는 기술이다. WISH 기술은 광범위하게 설명되었지만, 다양한 색상의 기판뿐만 아니라 수행 할 수 플루orescent 탐지 시스템 12-20. 여기에서 우리는 개발의 tailbud와 분할 단계 사이에 제브라 피쉬 배아에 사용되는 우리의 수정 WISH 프로토콜을 제공합니다. 아래 프로토콜의 초기에 언급 한 바와 같이 대체 WISH 프로토콜은 그러나 여기서 설명하는 플랫 마운트 절차와 호환된다. 또, 평면 실장 등이 프로토콜에 설명되지 않은 전체 마운트 면역 조직 또는 세포 계보 추적 라벨 등 기존의 시각화 기법을 임의의 개수와 함께 이용 될 수있다. 전반적으로, 평면 설치의 기술은 더 나은 제브라 피쉬의 배아 발달의 초기 단계 실험에서 얻은 데이터의 뛰어난 분석 및 프리젠 테이션을 활성화 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라 피쉬는 최근 몇 년 동안 연구 커뮤니티 전반에 걸쳐 매우 중요한 모델 생물적일 수있다. 제브라 피쉬가 높은 척추 동물의 유전 적 보존의 상당한 정도를 전시하고, 그들의 해부학, 번식 및 수명주기에 관한 장점은 실험 분석이 종은 매우 순종합니다. 더욱이, 제브라 피쉬에 적용 분자 기술의 진보는 더욱 과학적 연구에서이 모델 생물의 사용을 장려하고있다. 예를 들어, 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 큰 다양성은 질병의 진행을 연구하고 기관 형성 등의 개발의 핵심 메커니즘을 기초 많은 근본적인 질문에 대답하기 위해 생성되었습니다.
따라서, 질병 및 개발 연구 모두에서 제브라 피쉬의 동적 사용을 기반으로, 세포 라벨링 방법 및 신호 정량 데이터 분석의 중요한 부분입니다. 동안 형광등을 사용 방법tibodies가 형질 전환 지브라 피쉬에서 단백질 발현을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 연구자들은 전형적으로 고정 된, 비 – 형질 전환 지브라 피쉬 샘플의 유전자 전 사체의 시공간 현지화를 검사 WISH 12-16 같은 표준 절차에 의존한다. 사실, WISH 생물학 (16)에서 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이며, 유전자 돌연변이 및 화학적 유전 섭동의 표현형을 특성화하는 데 사용되는 중요한 도구이다. 그럼에도 불구하고, WISH는 잠재적 인 함정과 도전의 번호와 연결되어 있습니다. 안티센스 ribroprobe의 특이성을 확인하기 위해, 감지 리보 프로브는 안티센스 riboprobe 염색 패턴의 특이성을 평가하기위한 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 섹션 (4, 5)는 라벨 및 플루오 레세 인 표지 프로브이어서 digoxygenin-표지 프로브의 검출 순서로 제시되어 있지만,이 순서는 역전 될 수있다. 일반적으로 약한 신호 (낮은 발현 수준과 유전자) 최고의 digoxygenin 표지 프로브 및이 얼룩 감지탐지 및 레드 기판을 사용하여 강한 신호 (더 풍부하게 표현 된 유전자)의 염색 뒤에 보라색 기판으로 처음 개발. 두 색 반응이 수행하려는 경우, 그것은 라벨 및 기판의 다양한 조합이 데이터 수집 및 분석을위한 가장 적합한 절차를 찾기 위해 검사되는 것이 추천된다. 또한, 시간은 4 ~ 5가 24 시간 게시물 수정 미만의 태아에게 맞는 절에서 제공하는 항체 배양 및 세척을 차단 제공; 이전의 배아와이 동일한 단계의 긴 간격으로 샘플에 소금 축적으로 이어질 수 있습니다. 표준 제브라 피쉬 배아 WISH 문제 해결을위한 광범위한 팁은 이미 문학 12 ~ 16에 기록되어있다. 틀림없이 가장 일반적인 딜레마는 높은 배경이다. 우리는 필요한 경우 하룻밤 MABT '슈퍼 워시'의 추가는 우리의 경험, 생각, 단계 4.7 15-20 세척에 MABT 세척의 수를 증가 추천4.8 단계로 진행하기 전에 10 개 이상의 짧은 MABT 세척과 함께 사용하면 뛰어난 결과를 제공합니다. 또 다른 예를 들어 딜레마 긴 리보 프로브에서 발생할 수있는 불량 프로브 침투입니다. 알칼리 가수 분해를 통해 단계 3.6 다음 riboprobe 전단은 이에 대응 할 수 있습니다. 젊은 샘플 우리의 경험에서, 프로브 전단은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나, 하나는이 소원 실험의 결과에 영향을주는 요소 수와 같은 매개 변수에 유의해야하고, 우리는 필요에 따라 자신의 소원 실험 매개 변수를 세분화하는 사회에서 이미 공개적으로 사용할 수있는 유용한 문제 해결 지침의 검토를 제안 연구 12.
기존의 WISH 기술 12-16 외에도 WISH 방법론과 공식화 된 다른 프로토콜의 발전의 지속적인 출현이 있었다. 여기에는 fluores의 사용을 통해 같은 신호 검출하는 새로운 방식을 포함cence 17-19, 마이크로 RNA (20)의 국산화를 가능하게 방법에 관한 것이다. 얼룩 (들)이 쉽게 원하는 시점에서 관심의 샘플 내에서 시각화 할 수없는 경우도 있으므로, 현재 셀의 표시 방법에 적용된 많은 개선에도 불구하고, 이러한 절차의 효과는 무효가됩니다. 이 제한은 잠재적으로이 시간에 발생하는 다양한 발달 과정에 대한 우리의 이해의 격차로 이어질 수있는, 그것은 제브라 피쉬의 개체 발생의 초기 배아 단계에 관한 특히 연구자에 대한 문제가있다. 정상적인 제브라 피쉬를 개발하는 동안, 난황은 점진적으로 배아 나이 11로 크기가 감소합니다. 배아가 인접 난황에 비해 크기 때문에 따라서이 나중에 발달 단계 (> 24 시간 게시물 수정)에서, WISH 염색을 분석하는 매우 간단합니다. 그러나,이 (초기 somitogenesis에 꼬리 봉오리 단계로부터 그렇지 않은 경우 배아불투명 난황 가끔 얼룩의 시각화를 모호하게 할 수있는 질량은) 노른자 주위에 위치한다. 결과적으로, 평면 실장의 방법은 (도 1 및도 2에 도식화) 초기 지브라 피쉬 배아 샘플의 특성화와 관련된 영상 및 데이터 분석 문제를 완화하기 위해 고안되었고, 광범위 절연 유전자 변이의 체계적인 표현형 이후 사용되어왔다 첫 번째 큰 규모의 유전 화면 21.
평면 실장 기술의 출현 이후, 초기 발달 단계의 분석은 크게 향상되었다. 노른자는 배아에서 제거되면, 이미지의 원하는 방향으로 유리 슬라이드에 배아 평면을 배치 할 수있다. 이 2 차원 위치는 시료를 회전시킬 필요성을 제거하는, 한번에 전체 배아의 시청을 가능하게한다. 많은 조직은 같은 배아의 광범위한 영역에있는혈액 및 신장을 형성 전구체. 또한, 하나는 한 번에 여러 가지 개발 조직을 비교할 필요가있다. 평면 설치 동시에 휴대 그룹의 전체 도메인을 볼 수, 따라서 크게 같은 조직 또는 세포 카운트에 대한 면적 측정 등 quantifications 도움이 될 수 있습니다 연구원 수 있습니다. 이 기술은 궁극적으로 조혈, 신경 및 기관 형성의 기초가 중요한 발달 다양한 메커니즘에 관한 많은 발견으로 이어질 도움이되었습니다. 따라서, 한 번 마스터, 연구원이 간단한 기술에 대한 응용 프로그램은 매우 충실합니다.
예를 들어, 조혈 동안 계보 선택을 검토 한 연구에서, 평면 14, 18 체절 단계 (SS)에 제브라 피쉬 배아의 준비를 마운트는 사이 PU.1 아연 손가락 전사 인자의 발현 패턴에 발생한 변경 사항을 설명하기 위해 사용 된 야생형과 gata1 모르 폴리 노 배아 (22)를 주입했다.이 방법은 gata1 가장 가능성이 시점 주위 중간 세포괴 (ICM)에 PU.1의 발현을 조절하는 것을 나타내는, 18 SS에서 확장 PU.1 도메인의 검출을 가능하게했다. / – – gtpbp1 및 epsin 등 다양한 적혈구 유전자 스테인드 추가 평면 장착 배아는 gata1했다 VLT 돌연변이 체에서 이러한 유전자의 표현의 손실을 보여 주었다. 또한 분석 biklf 및 GATA 활동에 독립적으로 알려졌다 testhymin 같은 erythoid 유전자의 발현에 변화가 없었다. 따라서, 자신의 다른 실험 결과와 함께, 그것 gata1가 myelo-적혈구 계통 내의 세포의 분화 조절에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 신경 능선 개발의 연구에서, 평면 마운트는 연구 (마피아 M610) 돌연변이 몽 블랑에 crestin 식을 검사하는 데 사용되었다몽블랑과 tfap2a 유전자의 기능 (23)의 역할을 조사. 10, 20 SS에서 crestin 표현은 완전히 머리를 폐지하고, 궁극적으로 몽블랑의 중요성과 tfap2a 규제에 결론이 그룹을 보조, 일반 야생 형 식에 비해 폭도 M610 돌연변이의 트렁크 지역에서 감소 하였다 신경 능선을 형성하는 동안. 또한, 기관 형성의 측면에서, 평면 마운트 pronephros로 알려진 제브라 피쉬 배아 신장의 개발 과정에서 초기 신장 전구 필드에 고유 한 도메인의 존재의 발견을 사용할 수있다. 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포가 pronephros을 구성하는 네프론 기능 단위로 상승을 제공하는 방법을 연구하는 보존 아직 해부학 간단 시스템, nephrogenesis 6,7로 알려진 프로세스 (그림 4)를 제공합니다. 플랫 마운트 분석은 다시의 문서 도메인에 유용했다NAL 조상 이전에 알려지지 않았다 (그림 5), 6,7 패터닝 pronephros 동안 RA 신호의 변화의 결과를 해부하다. 이와 함께, 이러한 예는이 평면 정상적인 발달 및 질병 상태 중에 발생하는 다양한 과정의 연구에 마운트 프로토콜에 대한 많은 다양한 응용 프로그램이 실제로 있다는 것을 시사한다.
개념적으로,이 평면 마운트 절차는 전반적으로 매우 간단하다. 그러나,이 방법을 마스터하는 데 필요한 기교의 조작과 정도는 시각적 데모의 부재에서 마스터에 매우 도전이 될 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜은 연구자, 더이 기술을 수행하고 조직의 처리를 최적화 할 수있는 시약에 대한 우리의 조언을 공유하는 방법을 이해하는 기회를 제브라 피쉬 모델에 새로운 특히를 사용하도록 컴파일 된. 우리는이 프로토콜은 궁극적으로 지역 사회에서 다른 사람들이 U로 가장 이상적인 샘플 조건을 세분화 할 수 있기를 바랍니다SED 프리미엄 이미징, 데이터 분석 및 출판물에 그 결과를 통신. 궁극적으로,이 실험 결과의 프레 젠 테이션을 모호하게 할 수있는, 초기 배 발생 중에 제브라 피쉬의 해부학 적 방해물을 극복하기 위해 연구를 활성화하고이 간단하지만 중요한 기술의 사용을 통해 이러한를 해결해야합니다.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 다음의 각에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : NIH 보조금 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237; 5-FY12-75 천 바질 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작합니다. 우리는 특히 줄기 세포 연구 육성 노트르담 대학에 관대 한 선물을 부여 전체 갤러거 가족과 함께, 엘리자베스와 마이클 갤러거에게 감사의 말씀을 전합니다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학학과의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호와 복지에 탁월한 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는 것과 같이, 자신의 의견, 토론과이 작품에 대한 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사물론 자연적으로 우리의 연구를위한 가장 우수한 채찍 도구를 만들기 위해 고양이 수염을 흘렸다 제공하는 메리 골드 (Maripooka)와 초속 Wingert 등.
Materials
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
| block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
| slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
Referanslar
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