הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em> באתרו</em> הכלאה
Özet
עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.
Abstract
עובר דג הזברה הוא כעת בשימוש נפוץ למחקר בסיסי ויו לחקור את הבקרה הגנטית של תהליכים התפתחותיים ולמודל מומים מולדים. במהלך היום הראשון לחייהם, עובר דג הזברה מתקדם דרך שלבי התפתחות רבים כולל הפריה, מחשוף, gastrulation, פילוח, וorganogenesis של מבנים כגון מערכת עצבים מרכזית בכליות, לב, ו. האנטומיה של עובר דג הזברה צעיר מציגה כמה אתגרים להדמיה והניתוח של הרקמות מעורבות ברבים מהאירועים האלה כי העובר מתפתח בשיתוף עם מסת חלמון עגולה. לפיכך, לניתוח והדמיה של פנוטיפים ניסיוניים בדגימות עובריים קבועות בין tailbud ו20 שלב somite (10 ו19 שעות שלאחר הפריה (hpf), בהתאמה), כמו אלה מוכתמים באמצעות מדויקים הר שלם הכלאה באתרו (לוואי), זה הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסיר את העובר מן החלמון בכל וכדי למקם אותו שטוח בשקופית זכוכית. עם זאת, ביצוע הליך הר שטוח יכול להיות מייגע. לכן, מוצלח ויעיל שטוח הר ההכנה היא הקל מאוד דרך ההפגנה החזותית של הטכניקה לנתיחה, וגם עזרו באמצעות חומרים כימיים המסייעים בטיפול ברקמות אופטימליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול הרצון שלנו לגילוי אחד או בשני צבעים של ביטוי גנים בעובר דג הזברה, ולהדגים כיצד הליך ההרכבה השטוח יכול להתבצע על דוגמא זו של מוכתמת דגימה קבועה. פרוטוקול הרכבה שטוח זה החלים רחב לחקר מבנים רבים עובריים העולות במהלך פיתוח דג הזברה מוקדם, ויכול להיות מיושם בשיתוף עם שיטות צביעה אחרות שבוצעו על דגימות עובר קבועות.
Introduction
דג הזברה, Danio rerio, הפכה לאורגניזם בשימוש נרחב בחקר הביולוגיה התפתחותית. דג הזברה הם טרופי מיני חוליות של מים מתוקים, השייכת למשפחה Cyprinidae. דג הזברה שימשו במקור למחקר סביבתי כדי להשיג מידע על הסיכונים של מזהמי מים פוטנציאליים, כפי שהיו השגה בקלות, זולים, וקל לתחזוקת 1. בשלושים השנים האחרונות, דג הזברה הפכה מוכרת כמערכת מודל חוליות גנטית צייתנית עבור שורה של סיבות. דג הזברה מראה רמה גבוהה של שימור אנטומיים ופיזיולוגי עם חוליות גבוהות כולל יונקי 2,3. ביאור רצף הגנום לאחרונה גילה כי כ -70% מהגנים באדם יש מקבילה דג הזברה אחד לפחות 4. לדוגמא, רבים גנים orthologous כי לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות כליות זוהו בין המינים אלה 5-7. חדר כל זהתואר Matic של שימור בכל הקשור לביולוגיה תאית ומולקולרית אפשר לחוקרים ליצור מודלים עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם בדג הזברה 8, ודג זברה הפכו כלי רב ערך כדי לזהות טיפולים תרופתיים פוטנציאליים באמצעות מסכי גנטיים כימיים 9.
יתר על כן, מודל דג הזברה הוא לא רק מסוגל לשחזר מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים מורכבים ומדינות מחלה כי הם ראו בבני אדם, אבל כמה תכונות נוספות גם להגביר את האטרקטיביות שלו כאורגניזם מודל למחקרים עובריים. דג הזברה הוא מטיל ביצים ומתרבה באמצעות השרצה שידור, המספקת לחוקרים עם גישה קלה לעוברים מהתחלתה של הפריה 10. יתרונות נוספים כוללים גודל עובר, שקיפות, והתפתחות מהירה, חיצונית 10. בנוסף, מבוגרים דג הזברה יש פוריות גבוהה ובדרך כלל לייצר בגדלים מצמד גדולים יחסית שיכול לנוע בין 200-500בשבוע, סופו של דבר מאפשר לחוקרים לבצע ניסויי תפוקה גבוהים, כגון מסכי כימיים פנוטיפ מבוסס, בקלות 9.
אף על פי כן, למרות שפע של יתרונות שמוצגים על ידי מודל דג הזברה, ישנם אתגרים הנוגעים לניתוח והתקשורת של תוצאות הניסוי המתקבלות משלבי התפתחות מוקדמים. במקרים מסוימים, את האנטומיה הפנימית של עובר דג הזברה יכולה לטשטש ויזואליזציה של נתונים של אחד. לאחר הפריה, התא הראשוני עובר אירועי מחשוף מרובים כפיתוח מתקדם 11. בעקבות gastrulation, הציר העוברי מתגלה בשלב tailbud (10 hpf), כך שהוא עוטף את החלמון 11. כפיתוח הבא מתקדם דרך תקופת הפילוח, תא המטען יגדל במסה וגם להאריך ידי התארכות צירית כך שזנב יחד עם חלק מצק החלמון עצמו להאריך מ המוני החלמון המרכזי11. בין tailbud ו20 שלב somite (19 hpf), מנסה להתבונן בתכונות התפתחותיים ספציפיות לאחר הניצול של פרוטוקולי צביעה שונים, כגון רוצה, יכול להיות מאתגר גם כדי לחזות ולצלם בשל הגיאומטריה של העובר ואטימות של שק החלמון. דרך אחת לחסל את האתגרים הללו היא להסיר את החלמון ולאחר מכן לשטח את העובר למדגם דו ממדים שניתן לנתח באופן ישיר יותר.
משאבי הפרוטוקול והסרטון הבאים מספקים מדריך לאיך deyolk בהצלחה ושטוח הר עובר הבא קיבוע וצביעה, תוך שימוש בדוגמא של אחד או הכתמה מאחלת בשני צבעים. רצון הוא טכניקה בשימוש נרחב, המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין ספציפיות בדגימות נשמרו ובכך מאפשרת לאתר (ים) של ביטוי גנים כדי להתגלות בתוך רקמות. טכניקות מאחלות כבר תוארו בהרחבה, וניתן לבצעו עם מצעים בצבע שונים, כמו גם שפעתמערכות גילוי orescent 12-20. כאן אנו מספקים פרוטוקול המאחלים שונה שלנו המשמש לעוברי דג הזברה בין שלבי tailbud ופילוח של פיתוח. פרוטוקולים מאחלים אלטרנטיביים, לעומת זאת, עולים בקנה אחד עם הליך ההר השטוח שתואר כאן, כפי שציינו בתחילת דבריו של הפרוטוקול בהמשך. בנוסף, הרכבה שטוחה יכולה להיות מנוצל בשיתוף עם מספר כלשהו של טכניקות הדמיה קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה ההר שלמה, או תוויות מעקב שושלת תא, שאינם מתוארות בפרוטוקול זה. בסך הכל, בטכניקה של הרכבה שטוחה יכולה יותר לאפשר ניתוח והצגה מעולים של נתונים המתקבלים מניסויים בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות עוברית בדג הזברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג הזברה הוכיחו להיות אורגניזם מודל יקר מאוד בכל רחבי קהילת המחקר בשנים האחרונות. דג הזברה להפגין מידה ניכרת של שימור גנטי עם זה של בעלי חוליות גבוהות יותר, ויתרונות הנוגעים לאנטומיה, הרבייה, ומחזור החיים שלהם להפוך את המין הזה מאוד נוח לניתוח ניסיוני. יתר על כן, הקידום של טכניקות מולקולריות החלים על דג הזברה קידם עוד יותר את השימוש באורגניזם מודל זה במחקר מדעי. לדוגמא, מגוון רחב של קווי דג הזברה מהונדסים כבר נוצר כדי ללמוד את התקדמות מחלה וכדי לענות על שאלות מהותיות רבות העומדות בבסיס המנגנונים המרכזיים של פיתוח כולל organogenesis.
בהתאם לכך, המבוסס על השימוש הדינמי של דג הזברה בשתי מחלות ומחקר התפתחותי, מתודולוגיות תיוג תא וכימות אות הם היבט חיוני של נתונים ניתוח. בעוד שיטות שמעסיקות ניאוןtibodies יכול לשמש כדי לזהות ביטוי חלבון בדג זברה מהונדס, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על נהלים סטנדרטיים כמו מאחל 12-16 לבחון את לוקליזציה spatiotemporal של תעתיקי גנים במדגם דג הזברה, שאינו מהונדס קבוע. למעשה, רצון הוא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בביולוגיה 16, והוא כלי חיוני המשמש כדי לאפיין את הפנוטיפ של מוטציות גנטיות והפרעות גנטיות כימיות. יחד עם זאת, משאלה קשורה במספר מלכודות ואתגרים פוטנציאליים. כדי לאשר את הספציפיות של ribroprobe antisense, יכולה לשמש riboprobes התחושה כביקורת על מנת להעריך את הספציפיות של דפוסי מכתים riboprobe antisense. בעוד סעיפי 4 ו 5 מוצגים לפי הסדר של תיוג וזיהוי של חללית שכותרת digoxygenin ואחרי בדיקה שכותרתו והעמסת, יכול להיות הפוך צו זה. בדרך כלל, אותות חלשים (גנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר) מזוהים ביותר עם בדיקות שכותרת digoxygenin והכתם הזהפותח לראשונה עם מצע סגול, ואחרי זיהוי וצביעת האות החזק (גן הביע יותר בשפע) באמצעות המצע האדום. עם זאת, אם תגובות בשני צבעים הולכים להתבצע, מומלץ ששילובים שונים של תוויות ומצעים נבדקים כדי למצוא את ההליך כי הוא מתאים ביותר לאיסוף נתונים ולניתוח. בנוסף, הפעמים הניתנות לחסימה, דגירה נוגדן ושטיפה אמורה בסעיפים 4-5 מותאמים לעוברים צעירים מ24 שעות שלאחר הפריה; מרווחים ארוכים של אותם שלבים עם עוברים מבוגרים יכולים לגרום להצטברות מלח על המדגם. טיפים נרחבים לפתרון בעיות מאחלות עובר דג הזברה סטנדרטית כבר תועדו בספרות 12-16. ניתן לטעון את הדילמה הנפוצה ביותר היא רקע גבוה. אנו ממליצים להגדיל את מספר שטיפות MABT ב4.7 ל15-20 שוטף שלב במידת צורך, אם כי, בניסיון שלנו התוספת של 'סופר השטיפה' MABT הלילהנותן תוצאות יוצאות דופן הפועלת בשיתוף עם 10 או יותר שטיפות MABT קצרות לפני שתמשיך לשלב 4.8. דילמת דוגמא נוספת היא חדירת בדיקה עניות, אשר יכול להתרחש עם riboprobes הארוכה. גז riboprobe הבא שלב 3.6 באמצעות הידרוליזה בסיסית יכול לנטרל את זה. מניסיוננו עם דגימות צעירות, לא נדרש גז בדיקה בדרך כלל. עם זאת, יש לזכור כי פרמטרים כמו זה יכול להיות גורמים תורמים בתוצאה של ניסוי משאלה, ואנו מציעים בחינה של ההוראות לפתרון בעיות שימושיות הללו כבר זמינים לציבור בקהילה לפי צורך כדי לשפר את הפרמטרים הניסיוניים למאחלים בעצמך מחקר 12.
בנוסף לטכניקות מאחלים מסורתיות 12-16, חלה צמיחה מתמדת של התקדמות במתודולוגיות רוצים ופרוטוקולים חלופיים שגובשו. אלה כוללים דרכים חדשות לזיהוי אות, כגון באמצעות השימוש בנורותcence 17-19, לשיטות המאפשרות הלוקליזציה של מיקרו RNA 20. אף על פי כן, למרות שיפורים הרבים שנעשו לשיטות תיוג התא הנוכחיות, את האפקטיביות של נהלים אלה שללו אם הכתם (ים) לא ניתן דמיינו בקלות בתוך המדגם של עניין בנקודת זמן רצוי. מגבלה זו היא בעייתית עבור חוקרים במיוחד כאשר הוא נוגע לשלבים העובריים המוקדמים של ontogeny דג הזברה, אשר עלול להוביל לפערים בהבנה של תהליכים התפתחותיים שונים המתעוררים בזמנים אלה שלנו. במהלך פיתוח דג הזברה רגיל, שק החלמון יהיה בהדרגה הירידה בגודל כמו גילאי עובר 11. לכן, בשלבי התפתחותיים המאוחרים יותר אלה (> 24 שעות שלאחר הפריה), מכתים מאחל הוא פשוט למדי כדי לנתח כי העובר הוא גדול יותר בהשוואה לצק החלמון הצמוד שלה. עם זאת, זה לא המקרה מהשלב ניצן הזנב לsomitogenesis מוקדם (כאשר העוברימסה ממוקמת סביב החלמון) שבו שק החלמון האטום לפעמים יכול לטשטש את ההדמיה של הכתם. כתוצאה מכך, השיטה של הרכבה שטוחה תוכננה כדי לעזור להקל על בעיות ההדמיה וניתוח נתונים הקשורים לאפיון של דגימות מוקדם דג הזברה עובר (schematized באיור 1 ואיור 2), וכבר בשימוש רחב מאז phenotyping השיטתי של מוטציות גנטיות מבודדות מהמסכים בקנה מידה הגדולה הראשונים הגנטיים 21.
מאז כניסתו של טכניקת ההרכבה שטוחה, הניתוח של שלבי התפתחות מוקדמים שופר באופן משמעותי. ברגע שהחלמון הוא להסיר את העובר, ניתן להניח שטוח העובר בשקופית זכוכית בכיוון הרצוי להדמיה. עמדה דו ממדים זה מאפשרת צפייה של כל העובר בבת אחת, מה שמבטל את הצורך לסובב את המדגם. רקמות רבות נמצאות בתחומים רחבים של העובר, כגוןסימנים מקדימים היוצרים את הדם והכליות. יתר על כן, אפשר צריך להשוות את מספר רקמות מתפתחות שונות בכל פעם. הרכבה שטוחה מאפשרת לחוקר בו זמנית כדי להציג את התחום כולו של קבוצות תאים כאלה, ולכן יכול מאוד לסייע quantifications כגון מדידת שטח לרקמות או ספירת תאים. טכניקה זו סופו של דבר סייעה להוביל לתגליות רבות הנוגעות למגוון רחב של מנגנוני התפתחות חשובים שבבסיס hematopoiesis, נוירוגנזה, וorganogenesis. לפיכך, שולטים פעם, הבקשות לטכניקה פשוטה זו עבור חוקרים הן משמעותיות למדי.
לדוגמא, במחקר שבחן בחירת שושלת במהלך hematopoiesis, שטוח הר הכנות של עוברי דג הזברה בשלבי 14 ו18 somite (SS) שימש כדי להמחיש את השינויים שחלו בדפוס הביטוי של גורם שעתוק אצבע אבץ pu.1 בין morpholino wild-type ו gata1 הזריק עוברים 22.שיטה זו אפשרה את זיהוי של תחום pu.1 התרחב ב18 ss, המציין כי gata1 סביר להניח שמסדיר את הביטוי של pu.1 במסת תאי ביניים (ICM) סביב נקודה זו בזמן. עוברי דירה נוסף רכובים מוכתמים עבור גנים erythroid שונים כולל gtpbp1 וepsin הוכיחו הפסד בביטוי של גנים אלה במוטנטים VLT שהיו gata1 – / -. ניתוחים נוספים הראו שום שינוי בביטוי של גנים erythoid כמו biklf וtesthymin שהיו ידועים להיות עצמאי של פעילות gata. לכן, בשיתוף עם תוצאות הניסוי האחרות שלהם, נחשף כי gata1 חיוני בויסות ההתמיינות של תאים בתוך שושלת myelo-erythroid. במחקר של פיתוח רכס עצבי, תושבות שטוחות שימשו כדי לבחון ביטוי crestin במון בלאן מוטציות (M610 אספסוף) במחקרבוחן את התפקידים של מון בלאן ותפקוד גן tfap2a 23. ב10 ו20 ss, ביטוי crestin היה מבוטל לחלוטין בראשו וירד באזור תא המטען של מוטציות M610 אספסוף בהשוואה לביטוי הנורמלי wild-type, סופו של דבר מסייע לקבוצה זו להגיע למסקנה על החשיבות של מון בלאן וtfap2a רגולציה במהלך היווצרות רכס עצבית. בנוסף, במונחים של organogenesis, תושבות שטוחות אפשרו גילוי נוכחותם של תחומים שונים בתחום אב הכליות מוקדם במהלך ההתפתחות של הכליה העוברית דג הזברה, המכונה הכליה ראשית. עובר דג הזברה מספק מערכת שימור ובכל זאת מבחינה אנטומית פשוטה ללמוד כיצד אבות כליות להצמיח יחידות תפקודיות נפרון המרכיבות את הכליה ראשית, תהליך המכונה nephrogenesis 6,7 (איור 4). ניתוח הר שטוח כבר שימושי לתחומים מסמך מחדשאבות nal ולנתח את התוצאה של שינויים באיתות RA במהלך הכליה ראשית דפוסי 6,7 (איור 5), שהיה ידוע קודם לכן. יחדיו, דוגמאות אלו מצביעות על כך שיש אכן הרבה יישומים רחבים לכך שטוח הר פרוטוקול במחקר של תהליכים מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות נורמלית ומדינות חולות.
מבחינה מושגית, הליך ההר השטוח הזה הוא פשוט למדי כולל. עם זאת, המניפולציות ומידת העידון הנדרשת כדי לשלוט בשיטה זו יכולות להיות מאתגרות למדי לאדון בהעדר ההפגנה חזותית. לכן, פרוטוקול זה נערך כדי לאפשר לחוקרים, במיוחד אלה חדשים מודל דג הזברה, עם ההזדמנות להבין טוב יותר כיצד לבצע את הטכניקה הזו ולשתף את העצה שלנו על חומרים כימיים שיכול לייעל את הטיפול ברקמות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יהיה סופו של דבר לאפשר לאחרים בקהילה כדי לחדד את תנאי מדגם האידיאלי ביותר להיות uSED הדמיה פרמיה, ניתוח נתונים, ותקשורת של התוצאות שלהם בפרסומים. סופו של דבר, זה אמור לאפשר לחוקרים להתגבר על המכשולים האנטומי של דג הזברה בעובר מוקדם, אשר יכול לטשטש את המצגת של תוצאות ניסוי, ולפתור אותן באמצעות השימוש בטכניקה פשוטה אך משמעותית זו.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מימון לRAW מכל אחד מאלה: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; במרץ של הפרס להעניק # הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה. היינו במיוחד רוצים להודות לאליזבת ומייקל גלאגר, יחד עם כל משפחת גלאגר, שהנחילה מתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים ותובנות על עבודה זו שלהם, כמוגם ציפורן חתול (Maripooka) וZinnia Wingert למתן באופן טבעי לשפוך שפם של חתולים כדי להפוך את כלי ריסים מעולים ביותר למחקר שלנו.
Materials
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
| block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
| slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
Referanslar
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. 3rd ed. , (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
