Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em> In situ</em> Hybridisierung
Özet
Die Zebrafischembryo ist ein hervorragendes Modell für Entwicklungsbiologie Forschung. Während der Embryogenese entwickeln Zebrafisch mit einem Dottermasse, die dreidimensionale Herausforderungen für die Proben Beobachtung und Analyse präsentiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zweidimensionale Flachmontage Zubereitungen der ganze Berg in situ (WISH) gefärbt Zebrafischembryo Proben erstellen.
Abstract
Die Zebrafischembryo ist jetzt allgemein für die Grundlagenforschung und biomedizinische Forschung verwendet, um die genetische Kontrolle der Entwicklungsprozesse zu untersuchen und zu angeborenen Missbildungen zu modellieren. Am ersten Tag des Lebens, schreitet die Zebrafisch-Embryos durch viele Entwicklungsstadien einschließlich Düngung, Spaltung Gastrulation, Segmentierung und der Organogenese von Strukturen, wie den Nieren, Herz und Zentralnervensystem. Die Anatomie eines jungen Zebrafischembryos zeigt mehrere Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse der in vielen dieser Ereignisse beteiligt, da das Gewebe Embryo in Verbindung mit einem Runddottermasse. So ist eine genaue Analyse und Abbildung von experimentellen Phänotypen in festen embryonalen Proben zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstufe (10 und 19 Stunden nach der Befruchtung (hpf), respectively), wie sie gefärbt mit ganzen mount in situ Hybridisierung (WISH), es Oft ist es wünschenswert, den Embryo aus dem Eigelb zu entfernen balle und zu positionieren, flach auf einem Glasträger. Allerdings Durchführung einer flachen Montageverfahren kann sehr mühsam sein. Daher erfolgreiche und effiziente Flachmontage Vorbereitung ist stark durch die visuelle Demonstration der Präparationstechnik erleichtert und auch mit Reagenzien, die in der optimalen Handhabung Gewebe unterstützen geholfen. Hier bieten wir unseren WISH-Protokoll für ein-oder zweiFarbErkennung der Genexpression im Zebrafischembryo, und zeigen, wie die flache Montageverfahren kann auf diesem Beispiel eines gefärbten fixierten Probe durchgeführt werden. Diese flachen Montage Protokoll ist breit anwendbar auf die Untersuchung von vielen embryonalen Strukturen, die während der frühen Zebrafischentwicklung entstehen, und kann in Verbindung mit anderen Färbemethoden auf fest Embryo Proben durchgeführt umgesetzt werden.
Introduction
Der Zebrafisch, Danio rerio, hat sich ein weit verbreiteter Organismus in der Studie der Entwicklungsbiologie. Zebrafische sind eine tropische, Süßwasser-Wirbeltierarten aus der Familie der Karpfenfische gehören. Zebrafisch wurden ursprünglich für Umweltforschung verwendet, um Informationen über die Gefahren von möglichen Wasserschadstoffe zu gewinnen, da sie leicht zugänglich, kostengünstig und einfach zu behalten 1 waren. In den letzten dreißig Jahren hat der Zebrafisch werden als genetisch manipulierbaren Wirbeltier-Modellsystem für eine Vielzahl von Gründen anerkannt. Zebrafisch zeigen eine hohe anatomische und physiologische Erhaltung mit höheren Wirbeltieren einschließlich Säugetieren 2,3. Jüngsten Genoms Annotation hat ergeben, daß etwa 70% aller menschlichen Gene mindestens eine Zebrafisch-Gegenstück 4. Zum Beispiel haben viele orthologen Gene, die eine wichtige Rolle während der Nierenentwicklung spielen zwischen diesen Arten 5-7 identifiziert worden. Diese dramatic Konservierungsgrad in Bezug auf Zell-und Molekularbiologie konnten die Forscher Modelle für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen in der Zebrafisch-8 erstellen und Zebrafisch haben ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle medikamentöse Therapien identifizieren, mit chemisch-genetischen Screens 9 geworden.
Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Modell nicht nur in der Lage, eine Vielzahl von komplexen Entwicklungsprozesse und Krankheitszustände, die in den Menschen gesehen werden rekapitulieren, sondern mehrere zusätzliche Attribute seine Attraktivität erhöhen auch als Modellorganismus für embryologische Studien. Zebrafische sind eierlegend und reproduzieren durch Broadcast Laich, die die Forscher mit einfachem Zugang zu den Embryonen vom Beginn der Befruchtung 10 liefert. Weitere Vorteile sind Embryo Größe, Transparenz und eine schnelle, externe Entwicklungs 10. Zusätzlich Zebrafisch Erwachsenen besitzen eine hohe Fruchtbarkeit und erzeugen typischerweise relativ großen Kupplungsgrößen, die zwischen 200 bis 500 liegen kannpro Woche, so dass die Forscher schließlich Hochdurchsatz-Experimenten, wie Phänotyp Chemie Bildschirme, mit Leichtigkeit 9 durchzuführen.
Auch so, trotz der Fülle von Vorteilen, die durch die Zebrafisch-Modell gezeigt werden, gibt es Probleme, die mit der Analyse und Kommunikation der von der frühen Entwicklungsstadien erhaltenen Versuchsergebnisse beziehen. In einigen Fällen könnte die inhärente Anatomie des Zebrafischembryos der Visualisierung von Daten von einem zu verschleiern. Nach der Befruchtung der Ausgangszelle durchläuft mehrere Spaltungsereignisse wie die Entwicklung fortschreitet 11. Nach Gastrulation tritt der embryonalen Achse an der Schwanzknospen-Stufe (10 HPF), so daß es um das Eigelb 11 gewickelt. Als weitere Entwicklung schreitet durch die Segmentierung Zeitraum wird der Stamm in der Masse zu wachsen und auch verlängern durch axiale Dehnung, so dass ein Schwanz zusammen mit einem Teil des Dottersacks selbst erstrecken sich von der zentralen Dottermasse11. Zwischen der Schwanzknospe und 20 Somitenstadium (19 hpf), versucht, spezifische Entwicklungsmerkmale nach der Nutzung der verschiedenen Färbemethoden wie WISH zu beobachten, kann eine Herausforderung sein, sowohl aufgrund der Geometrie des Embryos und Deckkraft zu visualisieren und zu fotografieren der Dottersack. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu beseitigen, ist das Eigelb zu entfernen, und dann abzuflachen des Embryos in einem zweidimensionalen Probe, die in einer einfacheren Weise analysiert werden kann.
Die folgenden Protokoll-und Video-Ressourcen bieten eine Anleitung, wie Sie erfolgreich deyolk und Flachmontage einen Embryo nach Fixierung und Färbung, am Beispiel von ein oder zwei-Farben-WISH Färbung. WISH ist eine weit verbreitete Technik, die den Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren in Präparate ermöglicht und somit erlaubt die Stelle (n) der Genexpression in Geweben festgestellt werden. WISH Techniken sind ausführlich beschrieben und können mit verschiedenen Farbuntergründe sowie geführt werden Grippeorescent Detektionssysteme 12-20. Hier bieten wir unseren für Zebrafischembryonen zwischen den Schwanzknospe und Segmentierung Entwicklungsstadien verwendet modifizierte WISH-Protokoll. Alternative WISH-Protokolle sind jedoch mit der flachen hier beschriebene Montageverfahren kompatibel ist, wie eingangs der unten Protokoll vermerkt. Zusätzlich könnte flache Montage in Verbindung mit einer beliebigen Anzahl von bestehenden Visualisierungstechniken wie whole mount Immunhistochemie oder Zelllinie Spurmarkierungen sind, die in diesem Protokoll beschrieben sind, verwendet werden. Insgesamt kann die Technik der flachen Montage besser ermöglichen eine optimale Analyse und Präsentation von Daten aus Versuchen mit den frühesten Stadien der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafische haben sich als ein äußerst wertvolles Modellorganismus in der gesamten Forschungsgemeinschaft in den letzten Jahren. Zebrafisch zeigen einen hohen Grad an genetischer Naturschutz mit der höheren Wirbeltieren und Vorteile in Bezug auf ihre Anatomie, Zucht-, und Lebenszyklus machen diese Spezies sehr zugänglich für experimentelle Untersuchungen. Darüber hinaus hat die Weiterentwicklung der molekularen Techniken für den Zebrafisch ferner die Verwendung dieser Modellorganismus in der wissenschaftlichen Forschung gefördert. Zum Beispiel, eine große Vielfalt von transgenen Zebrafischlinien erzeugt worden sind, den Krankheitsverlauf zu untersuchen und viele grundlegende Fragen, die die wichtigsten Mechanismen der Entwicklung zugrunde liegen, einschließlich der Organ beantworten.
Demzufolge, basierend auf dem dynamischen Verwendung eines Zebrafischs sowohl Erkrankung und des Entwicklungsforschung, Zellmarkierungsmethoden und Quantifizierung Signal sind ein wichtiger Aspekt der Datenanalyse. Während Methoden, die eine Leuchtstoff beschäftigenAntikörpern verwendet werden, um die Proteinexpression in transgenen Zebrafisch erkennen, Forschern der Regel verlassen sich auf Standard-Verfahren wie WISH 12-16, um die raumzeitliche Lokalisierung von Gen-Transkripte in einer festen, nicht-transgenen Zebrafisch-Probe zu untersuchen. In der Tat ist WISH einer der am weitesten verbreiteten Techniken in der Biologie 16, und ist ein wichtiges Werkzeug, um den Phänotyp von genetischen Mutationen und genetischen Störungen chemische Charakterisierung. Dennoch ist WISH mit einer Reihe von möglichen Gefahren und Herausforderungen verbunden. Um die Spezifität des Antisense-ribroprobe bestätigen, können Sinn Ribosonden als Kontrolle, um die Spezifität des Antisense-RNA-Sonde Färbungsmuster Beurteilung verwendet werden. Während die Abschnitte 4 und 5 sind in der Reihenfolge der Kennzeichnung und Erkennung einer Digoxygenin-markierten Sonde, gefolgt von Fluorescein-markierten Sonde präsentiert, kann diese Reihenfolge umgekehrt werden. Typischerweise werden schwächere Signale (Gene mit niedrigeren Expressionsniveaus) am besten mit Digoxygenin-markierten Sonden und diese Färbung nachgewiesenentwickelt, zuerst mit einem violetten Substrat, gefolgt von der Detektion und Färbung des stärkeren Signals (mehr reichlich exprimierten Gens) unter Verwendung des roten Substrat. Jedoch, wenn zwei Farbreaktionen gehen geführt werden soll, empfiehlt es sich, dass verschiedene Kombinationen von Markierungen und Substrate getestet, um die Verfahren, die am besten für die Datenerfassung und-analyse werden. Darüber hinaus können die Zeiten für das Sperren, Antikörper-Inkubation und Waschen in Abschnitten 4-5 sind Embryonen, die jünger als 24 Stunden nach der Befruchtung zugeschnitten vorgesehen; zeitlichen Abständen dieser gleichen Schritte mit älteren Embryonen zu Salzanreicherung auf der Probe führen. Umfangreiche Tipps zur Fehlerbehebung Standard Zebrafischembryo wollen, haben bereits in der Literatur 12-16 dokumentiert. Wohl die häufigste Dilemma ist Hoch Hintergrund. Wir empfehlen die Erhöhung der Anzahl von MABT Waschungen in Schritt 4,7 bis 15-20 wäscht, wenn nötig, aber nach unserer Erfahrung die Zugabe der Nacht MABT "Super-Wash"gibt hervorragende Ergebnisse, wenn bevor Sie zu Schritt 4.8 in Verbindung mit 10 oder mehr kurze MABT Waschungen verwendet. Ein weiteres Beispiel ist schlecht Dilemma Sonde Infiltration, die mit langen Ribosonden auftreten können. Scheren der Riboprobe folgenden Schritt 3.6 durch alkalische Hydrolyse kann dem entgegenwirken. In unserer Erfahrung mit kleinen Proben wird Scher Sonde in der Regel nicht erforderlich. Allerdings sollte man bedenken, dass wie diese können Faktoren werden im Ergebnis eines Experiments WISH-Parameter zu halten, und wir schlagen vor Prüfung dieser nützlichen Anweisungen zur Fehlerbehebung bereits öffentlich in der Gemeinde bei Bedarf zur Verfügung, um die experimentellen Parameter für WISH in Ihrem eigenen zu verfeinern Forschungs 12.
Neben den traditionellen Techniken WISH 12-16, hat es eine kontinuierliche Fortschritte in der Entstehung von WISH Methoden und alternative Protokolle, die formuliert wurden. Dazu gehören neue Möglichkeiten der Signalerfassung, beispielsweise durch die Verwendung von FluoreszenzFluoreszenz 17-19, zu Methoden, die die Lokalisierung von microRNAs 20 zu ermöglichen. Auch so, trotz der vielen Verbesserungen, die Stromzelle Markierungsverfahren hergestellt wurden, die Wirksamkeit dieser Verfahren werden negiert, wenn der Fleck (en) kann nicht einfach in der Probe von Interesse zu einem beliebigen Zeitpunkt dargestellt werden. Diese Einschränkung ist problematisch für die Forscher vor allem, wenn es um die frühen embryonalen Stadien der Ontogenese Zebrafisch betrifft, die möglicherweise zu Lücken führen könnte in unserem Verständnis der verschiedenen Entwicklungsprozesse, die zu diesen Zeiten auftreten. Während des normalen Zebrafisch-Entwicklung, wird der Dottersack schrittweise zu verkleinern, wie die Embryo im Alter von 11. Daher wird bei diesen späteren Entwicklungsstadien (> 24 Stunden nach der Befruchtung) ist WISH Färbung relativ einfach zu analysieren, weil der Embryo ist größer im Vergleich zu den angrenzenden Dottersack. Dies ist jedoch nicht der Fall von Schwanzknospenstadium früh Somitogenese (wenn der embryonalenMasse um das Eigelb positioniert), wobei die opake Dottersack kann manchmal verdecken die Visualisierung der Fleck. Folglich ist die Methode der flachen Montage wurde entwickelt, um die Bild-und Datenanalyseprobleme mit der Charakterisierung der frühen Zebrafischembryo Proben (in Fig. 1 und Fig. 2 schematisch dargestellt) verbunden zu lindern, und ist breit, da die systematischen Phänotypisierung von genetischen Mutationen isoliert verwendet von den ersten großen genetischen Bildschirme 21.
Seit dem Aufkommen des flachen Befestigungstechnik hat sich die Analyse der frühen Entwicklungsstadien wurde erheblich verbessert. Sobald das Eigelb aus dem Embryo entfernt wird, ist es möglich, den Embryo flach auf einem Glasträger in der gewünschten Orientierung für die Bildgebung zu legen. Dieses zweidimensionale Position ermöglicht das Betrachten des gesamten Embryos auf einmal, wodurch die Notwendigkeit, die Probe zu drehen verhindert. Zahlreichen Geweben sind in breiten Bereichen des Embryos, wie sichdie Vorläufer, die die Blut-und Nieren bilden. Weiterhin kann man brauchen, um mehrere verschiedene Gewebe entwickeln auf einmal vergleichen. Flache Montage ermöglicht die Forscher gleichzeitig betrachten die gesamte Domäne solcher Zellgruppen, und kann somit große Hilfe Quantifizierungen wie einem Flächenmessung für ein Gewebe-oder Zellzahlen. Diese Technik hat sich letztlich dazu beigetragen, führte zu vielen Entdeckungen über eine Vielzahl von wichtigen Entwicklungsmechanismen Hämatopoese, Neurogenese und Organogenese zugrunde liegen. So, einmal gemeistert, die Anwendungen für diese einfache Technik für die Forscher sind ganz erheblich.
Zum Beispiel, in einer Studie, Abstammung Wahl während der Hämatopoese, flach montieren Zubereitungen von Zebrafischembryonen bei den 14 und 18 Somiten Stufen (ss) wurden verwendet, um die Änderungen, die in der Expressionsmuster des PU.1 Zinkfinger-Transkriptionsfaktor zwischen aufgetreten veranschaulichen Wildtyp-und GATA1 Morpholino injizierten Embryonen 22.Dieses Verfahren ermöglichte die Detektion eines erweiterten PU.1-Domäne bei 18 ss, die anzeigt, dass GATA1 ist wahrscheinlich die Expression von PU.1 in der Zwischenzellmasse (ICM) um diesen Zeitpunkt. Zusätzliche flach montiert Embryonen für verschiedene erythroid Gene einschließlich gtpbp1 und Epsin gefärbt zeigte einen Verlust in der Expression dieser Gene in vlt Mutanten, die GATA1 waren – / -. Weitere Analysen zeigten keine Veränderung in der Expression von Genen wie erythoid biklf und testhymin, die bekannt waren, unabhängig von gata Aktivität sein. Daher wird in Verbindung mit ihren anderen experimentellen Ergebnissen wurde gezeigt, dass GATA1 wesentlich bei der Regulierung der Differenzierung von Zellen in der erythroiden Abstammungslinie Myelom. In einer Studie der Neuralleiste Entwicklung wurden flache Halterungen verwendet werden, um Crestin Ausdruck in mont blanc untersuchen (mob m610)-Mutanten in einer StudieUntersuchung der Rolle von Mont Blanc und tfap2a Genfunktion 23. Bei 10 und 20 ss, wurde Crestin Ausdruck ganz in den Kopf aufgehoben und wurde im Rumpfbereich der Mob m610-Mutanten im Vergleich zu den normalen Wildtyp-Ausdruck zurück, schließlich Unterstützung bei dieser Gruppe, über die Bedeutung des Mont Blanc und tfap2a Regulierung schließen während Neuralleisteninduktion. Zusätzlich wird in Bezug auf Organ, Flachlager haben die Entdeckung der Anwesenheit von verschiedenen Domänen in den frühen Nierenvorläuferfeld während der Entwicklung des Zebrafisch embryonalen Niere, wie die Pronephros bekannt freigegeben. Die Zebrafischembryo bietet eine konservierte und doch anatomisch einfaches System zu untersuchen, wie Nierenvorläuferzellen führen zu den nephron Funktionseinheiten, die die Pronephros umfassen, ein Verfahren, wie bekannt Nephrogenese 6,7 (Abbildung 4). Wohnung montieren Analyse hat sich als nützlich erwiesen, um Dokument-Domänen der Wiedernal-und Vorläuferzellen, um das Ergebnis von Veränderungen in RA-Signalisierung während Pronephros Strukturieren 6,7 (Abbildung 5), die bisher unbekannt war sezieren. Zusammengenommen deuten diese Beispiele, dass es tatsächlich viele breite Anwendungen für diese Wohnung montieren Protokoll in der Studie der vielfältigen Prozesse, die während der normalen Entwicklung und Krankheitszuständen auftreten.
Konzeptionell ist diese flache Halterung Verfahren recht einfach insgesamt. Allerdings können die Manipulationen und der Grad der Finesse erforderlich, um dieses Verfahren beherrschen recht schwer zu meistern in der Abwesenheit von visuellen Demonstration sein. Daher wurde dieses Protokoll erstellt, um Forscher, vor allem diejenigen, die mit dem Zebrafisch-Modell, mit der Möglichkeit, besser zu verstehen, wie diese Technik durchführen und unsere Beratung zu den Reagenzien, Gewebe Handhabung optimieren können. Wir hoffen, dass dieses Protokoll wird letztlich anderen in der Gemeinschaft, die ideale Probenbedingungen zu verfeinern, um used für Premium-Bildgebung, Datenanalyse und Kommunikation der Ergebnisse in Publikationen. Letztlich sollte dies Forschern ermöglichen, die anatomischen Hindernisse des Zebrafisch während der frühen Embryogenese zu überwinden, welche die Darstellung der Versuchsergebnisse verschleiern kann, und lösen diese durch die Verwendung dieser einfachen, aber bedeutende Technik.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Finanzierung von RAW aus jeder der folgenden unterstützt: NIH Zuschüsse K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Zuschussvergabe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der Universität von Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. Besonders möchten wir auf Elizabeth und Michael Gallagher zu danken, mit der gesamten Familie Gallagher, der ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame verliehen zur Förderung der Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in dem Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der Notre Dame für ihre herausragende Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit, wiesowie Ringelblume (Maripooka) und Zinnia Wingert natürlich für die Bereitstellung von Schuppen Katzen Schnurrhaare, die meisten ausgezeichnete Peitsche Tools für unsere Forschung.
Materials
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
| block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
| slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
Referanslar
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