Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Mark A. Baker; Louise Hetherington; Anita Weinberg; Tony Velkov

doi:10.3791/51546

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Kemirgen Epididimal Spermatozoa'lar phosphopeptide Analizi

Published: December 30, 2014

doi:

10.3791/51546

Mark A. Baker¹, Louise Hetherington¹, Anita Weinberg¹, Tony Velkov²

¹School of Environmental and Life Science,University of Newcastle, ²Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences,Monash University

Özet

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO₂.

Abstract

Spermatozoa hücre tipleri arasında oldukça özeldir. Testiste üretilen rağmen ön-imleç yuvarlak hücreli uzatılmış ve morfolojik bir spermin olarak tanınan ne içine ayırt başlar kez, hem nükleer gen transkripsiyonu ve çevirisi kapatılır. Ancak, sperm hareketliliği veya yumurta tanınması için hiçbir yeteneğine sahip, çok olgunlaşmamış olduğunu. Bu olayların her ikisi de sperm geçiş kez epididim olarak bilinen ikincil bir organ meydana gelir. Bir sperm hücresi epididime geçmesi için gereken ~ 12 gün geçişi sırasında, mevcut proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar hücre olgunlaşmasında önemli bir rol oynamaktadır. Böyle bir büyük faset protein fosforilasyonu olduğunu. Sperm olgunlaşması sırasında oluşan fosforilasyon olaylarını karakterize etmek amacıyla, saf sperm hücresi popülasyonları ve Phosphopeptides ön ayırma hem de tespit edilmelidir. Saf sperm o izolasyonu için, bir yöntem yıkama teknikleri geri kullanmadistal veya kuyruk epididymisten f kaliteli ve verim özetlenmiştir. çözülmesi, sindirim ve _TiO2 afinite kromatografisi aracılığıyla spermin Phosphopeptides ön paya ayırma için adımlar açıklanmıştır. İzole sonra, fosfopeptidler, sperm olgunlaşması işlemleri sırasında fosforilasyonu yer alarak seviyelerini spesifik amino asit kalıntıları iki protein fosforilasyon olaylarını belirlemek ve ölçmek için, MS içine enjekte edilebilir.

Introduction

Testisten çıkan sonra, sperm oldukça henüz belirgin ayırt edilir, bu hücreler olgunlaşmamış ^1,2 bulunmaktadır. Gibi, onlar oosit ³ yüzmeye yeteneği ve bağlama dahil, komple işlevselliği eksikliği. Sperm daha olgunlaşması gerekmektedir, ancak, hücre farklılaşma bu aşamasında, bu gen transkripsiyonu ve daha fazla protein biyosentezi ⁴ yetersiz olduğundan, bu kanonik yollar ile meydana gelemez. Onlar testis terk ve epididim ⁵ olarak da bilinen erkek üreme sisteminin bir parçası girerken Biyolojik yetkinlik sperm üzerine haiz. epididimis vaz deferens için (testis) efferent kanalları birbirine bağlayan ve tüm erkek memelilerde ⁶ mevcut olan sıkı sarmal, son derece farklılaşmış tüp. Spermatozoa kademeli cr olduğunu sürekli değişen lümen ortama dayanarak, epididim iniş sırasında gübreleme potansiyeli kazanmakYerel epididimal epitel hücreleri ⁷ ile Eated. epididim ortam eyleminde bulunan çeşitli salgı ve yeniden emici faaliyetler protein, karbonhidrat ve lipid kompozisyonu ⁶ değişen, sperm kendisi değiştirmek için. Bu yapının özellikle ilk 'caput' bölge epididimis önemi, cerrahi ligasyon teknikleri kullanılarak ⁸ örneklenmiştir. Efferent kanalı ligasyonu ile testis içinde sperm tutulan tamamen oosit ^9-11 döller herhangi bir sıfatla eksiktir.

Epididimal ortamına ek olarak, sperm çalışma içinde sinyal iletim yolları translasyon sonrası mevcut sperm hücresi tamamlayıcı değiştirmek için kullanılır. Örneğin, epididim erken bölgelerinden sperm bu ikinci bölgelere ^5,12 oranla protein fosforilasyon farklı desen görüntüler. C büyük farklılıklar vardır çünkü bu şaşırtıcı değilBu bölgelerden sperm apability. Örneğin, erken gelen, epididim kaput spermatozoa immotilite vardır. Buna karşılık, kauda bölgeden sperm hücreleri ileri bir kez izotonik ortamda yerleştirilen ilerici hareketliliğini uğrayacaktır. Epididimal sperm hücrelerinin de novo protein sentezi aciz olduğu için, sperm fonksiyonunu düzenleyen tüm iç yolları post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) üzerinden olmalıdır. Bu nedenle, bu işlenmektedir nedenle duruyor ve biz sperm hücresi olgunlaşmasını anlamak istiyorsak özellikle fosforilasyon gibi PTMS soruşturma büyük bir itme olmalıdır.

Alternatif bir yöntem, ^13-16 retro geri akışlandırma kullanımı epididymidies spermatozoa elde edildi. Bu tekniğin kesinlikle daha zaman alıcı ve operatör tarafından beceri büyük bir derecesi alır rağmen, sperm sürekli% 99,99 aşan saflığını göstermek aldı. Buna ek olarak, tüm diğer tekniklerin aksine, sperm can mümkün sperm hareketliliği nasıl başladığı çalışma yapma, hareketsiz bir durumda izole edilebilir. Numune hazırlama proteomik analiz için en önemli unsur olduğundan, sperm izolasyon sperm proteomik çalışmaların en önemli yönlerinden biri haline gelmiştir. Bu protokol kauda epididimis izole nasıl sperm bir açıklama sağlar. Bunu takiben, _TiO2 fosfopeptid zenginleştirme işlemi son derece farklılaşmış sperm hücrelerinden peptidler ayıklamak için nasıl özel referans ile, ana hatlarıyla. MS yaklaşım bir tek devlet kaudal epididim sperm karşılaştırmak olsaydı değişen Phosphopeptides ayırt etmek için kullanılabilir (hareketsiz veya non-kapasitan) sperm incelemek için bu güçlü bir yaklaşım yapma (vb, tepki gösterdi hareketli, kapasitan akrozomun) başka işlevi.

Protocol

Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık 5.54 g NaCI, 0.356 g KCI, 0.25 g CaCl2, 0.162 g H-2 KO 4 P ve 0.294 gr MgSO 4 Milli-Q su içinde L1 eklenmesiyle Biggers Whitten ve Whitten (BWW) 17 çalışma çözeltisi 200 ml yapmak . Bu stok çözeltisi ve bir aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Stok solüsyonundan, NaHCO 3 420 mg ekleyin – 200 mg glikoz, 6 mg sodyum piruvat, 600 mg Sığır Serum Albümin, 0.74 ml sodyum laktat ve BWW stokunun 4.0 ml HEPES tamponu 193 mi. Bu çalışma çözeltisi ve her zaman kullanımdan önce gün taze yapılmış ve 37 ° C'de dengelenir. Kanül yapmak için, boru erimeye başlar ki (tipik olarak metanol alev) örneğin 0.4 mm bir iç çapa ve 1,1 mm'lik bir dış çapa sahip polietilen (PE) tüp almak ve düşük bir ısı üzerinde tutun. Hemen outw boru çekmeard germek ve dış çapı daha dar yapmak. Vaz deferens kolay kanülasyon için izin verir bir ucunda bir daralma üretmek için Kes. Yaklaşık 15 cm kanül diğer ucu kesilir. Künt ucunu 30 G iğne takın, ve buna bir 3 ml şırınga takın (tamamen geri çekilmiş). PE boru (4.2 mm iç çap, 6.4 mm dış çapında) bir 20 cm uzunluğunda kesilerek bir emme ağızlık yapın. Bir ucunda bir ağızlık yerleştirin. Mikro-kapiller cam tüp tutucu ve cam mikro-kılcal kendisi (bir fare için tipik 3 ul, bir sıçan için 40 ul) yerleştirin. Mouse epididimisten 2. Kaldırma Her kuruma özgü IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize. Hayvan al ve epididim maruz skrotum küçük bir kesi yapmak. Saatçilik 5. forseps bir çift kullanarak boşluğundan dışarı testis ve epididim çekin. Öyle ki en az 1-2 cm kauda epididimise bağlı kalır vas deferens kesin. Buna ek olarak, testis epididim bağlayan proksimal efferent kanalları ve doku kesip tüm erkek üreme parçayı çıkarın. 5-40X sırasına göre bir büyütme aralığında olan bir mikroskop altında tüm erkek üreme parçayı yerleştirin. 3. Epididimis cannulating Daralmış (koni şeklinde) sonunda 1-2 cm lens aracılığıyla ücretsiz ve görünür şekilde mikroskop kanül aşağı Teyp. Saatçilik 5. forseps bir çift alın ve yavaşça vaz deferens her tarafını toka ve kanül vaz deferens gider şekilde, kanül üzerine vaz deferens çekin. Emilmeyen siyah örgülü tedavi ipek (boyut 5-0) uzunluğu alın ve kanüle vaz deferens etrafında bir düğüm. Emin olun düğüm vaz deferens içinde kanül tutmak için sıkı çekildiğinde hava basıncı from şırınga uygulanır. 4. retrograd veya Caudal Epididimal Spermatozoa'lar Ters yıkama Saatçiler 5. forseps kullanarak, kauda epididymisten distal ucunu yakala ve bir tek epididim tübül ortaya koymak için tunika albuginea'yı kaldırın. Forseps kullanarak, hafifçe maruz tübül çekin ve sperm serbest bırakılması için bir açıklık oluşturmak amacıyla daha sonra ayrı kızdırmak. Vas deferens içine şırınga havayı atmak şekilde yavaşça 3 ml (fare) veya 20 ml (sıçan) şırınga itin. Uygun basınçta, sperm yavaş yavaş kauda epididimis uzak ucunda kırık tübül çıkmaya başlayacaktır. Bu zamanda, cam boru içine sperm çekmek için ağız emme uygulanır. Not: Genellikle bir farede, sperm 2-3 ul hayvanın yaşına bağlı olarak elde edilebilir. Bir sıçan irade, ortalama verim 30-40 ul üzerinde. 5. Yıkamave Proteomics Hazırlık spermatozoa Parçalama Yavaşça mikrofona üfleme veya bir şırınga takmak ve kılcal geri sperm itmek üzere havayı atarak BWW çözeltisi 1 ml çözelti (37 ° C) içine cam kapiller gelen sperm kovmak. Sperm hücrelerinin dağınık sonra, kirletici proteinleri uzaklaştırmak için 1 mi oranında BWW ile 3 kez (300 x g, 5 dakika) yıkanır. Son yıkamadan sonra, süpernatant kaldırmak. Not: Bu noktada, sperm hücreleri daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Aralıklı vorteks ile 1 saat süre ile 4% CHAPS, 2M tioüre ve 50 mM Tris, pH 7.4 kullanılarak proteinleri çözünebilir hale getirdi. Hücreler, santrifüj (10,000 x g, 20 dk) Lize etme sonrasında üstteki sıvı kısmı alınır ve yeni bir tüpe aktarılır. Not: Bu noktada, protein, miktar tayini yapılabilir. 6. disülfit bağ Azaltma ve Alkilasyonu Lize proteinlere nihai bir konsantrasyona kadar 10 mM DTT ekleme Vorty ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Lizat, girdaba nihai bir konsantrasyona kadar 50 mM idodoacetamide ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 7. Yağış Metanol kloroform, lizatın 1 hacim (örnek olarak 400 ul) ekleyerek örnek çöktürmek metanol bir hacmi (400 ul) ve 0.5 hacim (200 ul) kloroform ekleyin. Vortex örnek ve spin (10.000 xg, 2 dk). Iki faz santrifüj aşağıdaki görüneceğini unutmayın. Üst tabaka (dikkatli olmak arayüzü rahatsız değil) bütün fakat 2 mm atın. Metanol 1 hacim (400 ul) ekleyin, invert tüpü yavaşça (10.000 xg, 15 dk) karıştırın ve tekrar dönmeye 1-2x. 3-4 dakika atık süpernatant ve hava kuru pelet atın. 8. Tripsin Sindirim 50 oranında 1 M üre ihtiva eden 25 mM amonyum bikarbonat içinde tripsin sulandırın: 1 (a / a protein: tripsin) ve ove kuluçkalanmıştırtercihen bir termomikser üzerinde 700 rpm'de 37 ° C'de rnight. Sıkma (10,000 x g, 15 dakika) sindirilmemiş malzeme peletlendi. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın. 9. phosphopeptide Zenginleştirme Daha önce açıklandığı gibi 18 sindirmek triptik gelen arınma ve Phosphopeptides zenginleştirme gerçekleştirin. 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic asit (DHB),% 80 (h / h) ACN (asetonitril),% 2 (v / v) TFA (trifluoroasetik: Triptik peptitler DHB tamponunda 10 kat seyreltilir [DHB tamponu oluşmaktadır asit)] ve Tio 2 boncuk (200 mikrogram) kurumaya geçerlidir. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerinde bırakın. DHB tamponu ile örnek yıkayın dönmeye ve süpernatant kaldırmak. Daha sonra numune, yıkama tamponu [% 80 ACN (h / h),% 2 TFA (h / h)], DHB 'nin çıkarmak için üç kez yıkayın. Nihai döndürmesi sonrasında doğrudan% 2.5 amonyum hidroksit 25 ul, pH ≥ 10.5 çözeltisinin eklenmesiyle elüsyon tamponu kullanılarak fosfopeptidler tasfiye edilir. Spin ve süpernatant kaldırmak. Hemen ~ 0.3 ul formik asit ile nötralize.

Representative Results

Herhangi bir proteomik analiz sonuçlarının kalitesi başlangıç malzemesinin büyük ölçüde bağlıdır. Modern MS ile, örnek hazırlıkları hafif kirlenmeler kolayca toplanır. Bu nedenle, son derece saf sperm veren bir yöntemi seçmek için, sperm hücresi proteomik durumunda, önemlidir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, retrograd geri yıkama kauda epididimis sperm hücrelerini almak için kullanılır. Bu, bir yavaş yavaş ekli şırınga hava basıncını uygulamak sağlar PE boru ile vas deferens cannulating içerir. Şekil 1A vas deferens ile birlikte kauda epididimiti göstermektedir. Şekil 1B vaz deferens bağlı nasıl bir kadar yakın çekim olduğu kanül yerleştirilir. Yaparken, bu yüzden sperm kuyruk epididymisten bir tübül eksize sonunda serbest bırakılır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, sperm Caud tepe bölgelerinden ekstre edilmiştirBir Epididimis ve hareketsiz bir durumda (Şekil 2B) bir cam boru içine kadar emilir. Bu daha önce ve hareketlilik aktivasyonu sonrası sperm bir phoshoproteomic analizini gerçekleştirmek için yeteneği en az olan geleneksel "swim-up" yöntemleri, üzerinde birçok avantajı vardır. sperm sonra kişinin seçim ortamına ihraç edilebilir. Şekil 2C (sol taraf) sperm BWW ortama sınırdışı hemen sonra nasıl görüneceğini gösterir. Hücrelerin çoğu kümeleştiler edilir. Onlar solüsyonu (Şekil 2C, sağ tarafı hücreleri) içine homojenlik dışarı yüzmek Ancak, hücrelerin 10 dakika sonra yetkinlik gösterilmiştir. Geri yıkama tekniği sperm hücreleri çok az etkisi olduğundan, biz yakın% 100 motilite almak ve hücreler dış provokasyon olmadan ortama hızla dağılırlar. Tipik bir geri yıkama deneyde, sperm İsviçre-fare içerir kurtarıldı6 10 x 1-5 arası hücre. Bu hayvanın yaşına bağlıdır ve farklı fare suşları arasında değişebilir. Norveçli Rat, biz genellikle 200 x 10 6 sperm elde,% 20 ±. Şekil 2B sıçan kauda epididimis elde edilen sperm saflığını temsil eder. Numune kendisi dışında, örnek hazırlama ile ilgili önemli konulardan biri tripsin sindirimi ürünüdür. Protein çökeltme de proteinleri denatüre sadece MS ile uyumlu olan, her ikisi de, istenmeyen deterjanlar ve bunların tuzlarını, ortadan kaldırılması, çok önemli bir rol oynar. En iyi çalışması için metanol-kloroform çökelmesini bulduk. Sadece bu prosedür TCA yağış 19 olmak üzere diğerlerinden daha iyi düşük bol protein çöktürmek bildirilmiştir, ancak ek avantajlar sahiptir. TCA ile presipitasyondan sonra, oldukça kalabilir TSA pelletinin süspansiyonu ardından pH yeniden ayarlamak için genellikle gereklidirasidik. TCA Çökelen topak asiti çıkarmak için yüksek organik çözeltiler içinde yıkanabilir olsa da, bu taşıma ve sonuçların irreproducibility örnek ekler. Asidi nötralize etmek için ihmal kötü triptik peptid verimi ile sonuçlanır. Metanol-kloroform yağış sadece hızlı ama örnek asitleştirmek olmaz. 3 tipik alt ve üst interfazda arasındaki numune 100 ug görülen protein pelet göstermektedir Şekil. Phosphopeptides izolasyon bir dizi yolla meydana gelebilir; Ancak uyarlık örneği bu aşamada dahil kadar ele alınmış ve nasıl bağlıdır. Daha yaygın, gelişmekte olan yöntemlerden biri de TiO2 olduğunu, aslında Martin Larsen 18,20,21 grubu tarafından geliştirilen. Microcolumns kullanmak için bir işlem olarak açıklanmaktadır, ancak biz toplu kromatografisi kullanılarak tekrarlanabilir verileri de elde edebilir. sürecin başarısı elüsyon tamponu üzerinde bağımlı olduğu, deli olan olmalı Doğru bileşim ile, e; aksi takdirde fosfopeptidler hiç ayrıştırılmıştır değildir. TiO2 gelen protokol ve temsil verilerin tekrarlanabilirliği olmayan hareketsiz (Şekil 4 üst) ve m hareketli (Şekil 4 alt) devlet içinde kauda epididim sperm Phosphopeptides zenginleştirilmiş / z 650-670 görülebilir. Bu biyolojik çoğaltır 17 kullanıldığında bile bir çok tekrarlanabilir bir teknik olduğunu göstermiştir. zaman içinde ortaya çıkan mavi çizgiler asetonitril konsantrasyonu arttıkça, bir C 18 nano sütunundan elüsyon peptidlerdir. Açıktır ki, hareketli popülasyonda (n = 3, gösterilen, n = 8, tipik olarak çalışır), hareketsiz aralığında tamamen yok 651,5 Da aralığında etrafında monoizotopik kütle ile, bir peptid kümesi vardır. Tandem kütle spektrometresi bu peptidi tanımlamak için kullanılır. 546 / 51546fig1highres.jpg "/> Şekil 1:. Kauda epididimis kauda epididimis Kanülasyon (A) Resim. kanül kendisi önceden çekti sonundan itibaren yaklaşık 1-2 cm maruz aşağı bantlanmış. Bu ince # 5watchmakers forseps kullanarak vas deferens sokulur. (B) kanül vaz deferens ve kanül ikisini de içeren bir segmente çevresindeki ince ipek ipe yerinde tutulur. Fare kaynaktan, kuyruklu epididimal hücreleri ve sıvının yaklaşık olarak 2-3 ul, 1 x 10 6 / ul konsantrasyonunda toplanır. Sıçan (gösterilmemiştir) ilgili sıvının yaklaşık olarak 30-40 | il benzer konsantrasyonlarda elde edilir. Şekil 2: Yetkili epididim sperm toplamak için kullanılan cam kılcal. (A) kauda e apeksten biri tübül pididymis izole ve kırık. Bu gösterilen husule geldiği yaklaşık konum. (B) Görüntünün üst bir boş cam kapiller tüp gösterir ve alt önceden akıtmaya sıçan birini göstermektedir. Kan kontaminasyon ve minimal epitel hücre kontaminasyonu vardır. (C) sperm hala epididim sıvısında inceltilmiş gibi, onlar etkinleştirmek için başlamamıştır. Sperm başlangıçta BWW çözeltisi içine atılır, onlar bir kompakt "string" (Sol taraf) olarak çıkıyor. 10 dakika sonra sperm çoğu herhangi bir harici rahatsızlık (Sağ taraftaki) olmadan çözelti içine yüzmek beri hücrenin yetkinlik kolayca kurulur. (D) onlar yüzmeye bırakılmış hemen sonra kaudal epididim hücrelerinin bir kısım bir resmi dışarı hücrelerin saflığını gösterir. g3highres.jpg "/> Şekil 3:. Metanol-kloroform çökeltme sonra sperm çözünür olması, çözünür pay metanol-kloroform proteinleri ve kirletici maddelerin çıkarılması denatürasyonunu sağlamak için çökeltilir. protein topağı metanol / su ve kloroform fazlan arasındaki arabirimde görüntülenir. Bu pelet rahatsız etmemek için üst tabaka dikkatlice çıkarılır. Bu, protein kaybolur, böylece, üst fazın yaklaşık 2-3 mm bırakmak için yaygındır. Şekil 4:. Tipik TiO2 bakımından zenginleştirilmiş fosfopeptid profili açıklanan protokolü kullanarak, kaudal epididimal sperm (üst N = 3) hareketsiz ya izole edildi ya da hareketli devletler (alt, N = 3). ~ 651,5 D bir mono-izotopik kütle ile bir peptid kümesiBir hareketsiz olanlar (ok) hareketli populasyonda bulunan fakat tamamen yok olduğu gösterilmektedir. Bu tür karşılaştırmalar "etiketi içermeyen (MS bazlı)" olarak adlandırılır. Peptit, kitle ve tutma süresi, sonra peptid türetildiği proteinin tandem-kütle spektrometresi için bileşiği hedeflemek ve tanımlamak için kullanılır.

Discussion

sperm başarılı ve tekrarlanabilir proteomik analiz için kritik adımlar şunlardır: başlangıç malzemesinin 1) saflık; İstenmeyen tuzların ve deterjanların 2) çıkarılması; Tripsin proteinleri, yüksek bir verim sindirimi izin verecek şekilde 3) tam kapasitede proteinleri denatüre ve 4) peptidin kaybını azaltmak için kullanım örneği en aza indirir.

Başarılı bir şekilde cauda epididimisi Geri akış için, bu sperm çıkar olan alan bulmak için gereklidir. Sıçan ve farelerin her ikisinde de, bu epididimis kaudal bölgenin ortasında (Şekil 2A 'ya bakınız), konkav alanın üst ucunda. Bir vas deferens doğru daha gelirse, geri yıkama kolay ve başarı oranı genellikle yüksektir. Ancak, bu sperm sayılarının kaybı geliyor. Bir külliyatı daha yakın hareket ettirmeye çalışır Alternatif olarak, eğer o basınç miktarı epididymis yoluyla geri sperm itmek için gerekliEl kanallar epididime hasar kaçınılmaz oluşur, genellikle çok yüksek.

Epididimis Ters yıkama geleneksel sperm ^22-25 kaldırmak için su, doymuş, mineral yağ ve bir ortam olarak şırınga kendi içinde dengeli tuz çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilir. Her iki prosedürler LC-MS potansiyel sorunludur. İlk olarak, maden hiçbiri prosedürü taşınan böylece alınmalıdır temel proteomik analizi ve bakımı için dünya çapında kullanılan nano-C18 nano sütun engellemek için olasıdır. Bu durum ortaya çıkarsa, devam etmek imkansız ve örnek aslında kaybolur. Bu, başarılı olsa da, yakında BWW çözelti temas gelen en kısa sürede sperm çok hareketli hale kabul kaudal epididimal ile karıştırılır, ancak oranında BWW veya şırınga diğer dengeli tuz çözeltileri kullanılarak aşılabilir Hücreler. Bu sorunu aşmak için biz sadece hava ile sperm Backflush. Sadece Qual olansıvı bazlı yöntemler karşılaştırılabilir sperm Sığ, ama miktarı aynıdır.

Phosphoproteomics belki sinyal yolları sperm sonrası boşalma meydana hangi kurmak için tek yollarından biridir. Biz araştırıyoruz önemli yollardan biri kapasitasyon işlemidir. Bir yumurta bağlanabilen önce spermatozoa "kapasitasyonu" geçmesi gerekmektedir. Uygulamada, bu, bir süre için sperm inkübe edilerek esas olarak elde edilir (sıçan 1.5 saat, fare, 40 dakika, insan 3-24 saat), serum albümini BWW çözelti içinde gerçekleştirilir. Daha önce, ve diğerleri kapasitasyonu ilgili çeşitli kinazlar için bir rolü olduğunu göstermiştir. Ilgi, PKA silinmesi II olan sperm in vitro kendiliğinden yüzmek fareler üretmek, ancak hiperaktivasyondan ²⁶ uğramaz edebilir μ. İkinci sperm bir düşüğe, yüksek hız, düşük genlikli kendi yüzme desen değiştirmek sayede, kapasitasyon bir özelliğidirhız, yüksek genlik frekans yendi. Biz bu süreçte yer alan mansap kinazlar pp60-CSRC (SRC) dahil göstermiştir ^13,27 c-evet ²⁸ ve c-ABL ^14. İlginç bir şekilde, SRC inhibisyonu kapasitasyon bağımlı tirozin fosforilasyonunu ¹³ durur. Bununla birlikte, bu, SRC doğrudan tirosin fosforilasyonu ²⁹ genel başlaması ile ilintili olan değil ama bir fosfatazı ²⁹ regüle olabileceğini düşündürmektedir okadaic asit ile aşılabilir. epididim dışarı sperm zorlamak için bir araç olarak BWW kullanarak sorun bir kez aktive, fare sperm sadece yetkilendirmek için yaklaşık 40 dakika sürer olduğunu. Sperm izolasyonu 5 dak / fare ve genellikle birkaç fareler deneyde kullanılan alabilir göz önüne alındığında, daha sonra sperm deneyin başlangıcında vade farklı aşamalarında olur. Bunun üstesinden gelmek için, hava basıncı, cam kanül içine kuyruk epididimden sperm itmek için kullanılabilir. Sadece tüm sperm İnakt vardırive ve kaudal ortamda bulunacağını esas olarak, bu mümkün olmayan hareketli ve hareketli phosphoproteomics karşılaştırmak için yapar.

Iki farklı fonksiyonel durumlarda sperm karşılaştırırken phosphoproteomics için işleme örnek minimumda tutulmalıdır. Protein yağış 1) diğer geleneksel yöntemlere göre metanol kloroform kullanımı 2) tuz ve yağ hemen hemen tüm izlerini ortadan kaldırır ve 3) TCA ¹⁹ üzerinde düşük bolluk proteinleri çöktürmek için kanıtlanmış bir yeteneği vardır, ekstra yıkama adımlar ihtiyacını azaltır. Tripsin sindirimi öncesinde protein yağış proteini (tripsin sindirim yardımcı olan) denatüre bu yardım yapar, ancak hücre içinde bulunan MS-uyumsuz metabolitlerin birçok kaldırır sadece beri tavsiye edilir.

Sperm Phosphopeptides karşılaştırması çeşitli şekillerde yapılabilir. Başka bir bu temel düzeyde bir numunede belirlenen fosfopeptid basit bir karşılaştırılması, en"spektral sayımı" olarak bilinen işlemde örnek yapılabilir. Erken proteomik çalışmalar düşük çoğaltır kullanılarak çünkü Ancak eleştiri temelde bu yaklaşım olmuştur (dolgun bir tartışma için Lundren ark. ^30). Daha sofistike bir yaklaşım peptit ana kütlesinin yoğunluğu bakmak ve diğer örneklerin (etiket ücretsiz karşılaştırma) ile bu karşılaştırmaktır. Şekil 4'te gösterilen örnekte, m / z 650-670 olmayan hareketli dan (Şekil 4) durumunda mevcut değildir fakat hareketli olarak mevcut olan bir peptit (Şekil 4 alt) sperm görülebilir. MS temelli etiket serbest miktar olarak adlandırılır Bu işlem, bir etiket içermeyen bir stratejidir.

Yaygın proteomik ölçümü için gerekli çalışan miktarını azaltmak için kullanılan alternatif bir strateji izotopları kullanmaktır. Bir izotop kütle farklı olduğu için, kütle spektrometresi elüt yoğunluklarını karşılaştırmak için kullanılabilirpeptidler ing. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri farklı olarak, bazı izotopik etiketleme sperm tatbik edilemez. Doku kültüründe kullanılabilir Örneğin, kararlı izotoplar eklenmesi (bir hafif bir versiyonu başka ilave alır iken bir ağır izotop, bir örneğe eklendi alır). Izotoplar protein içine dahil olsun zaman, proteomik analizi iki numune (çoklayıcı) birleştirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte sperm durumunda bu, 1) izotop işaretleme doku kültüründe () 8 kadar çeşitli pasajlar gerektirir ve 2), sperm hücreleri, bu nedenle herhangi bir nükleer gen, transkripsiyon ve çeviri sahiptir ve bu sadece gerçeği sayesinde, yapılamaz onlar zaten tüm protein içine izotopları dahil değildir. Bu etrafında bir yolu, radyo-etiketli fare sipariş etmek, bununla birlikte, bu bildiği pahalıdır. Alternatif bir yaklaşım kimyasal etiketi kullanmaktır. Bu sigara kapasitan fareler kapasitan fareler ile karşılaştırıldığında yapılmıştır. Bu durumda, D ₀ ve D ise <sub> 3 -label kütle spektrometresi ³¹ bir örnek ve bir başka ayırt etmek için kullanıldı. Diğer yaklaşımlar lizinlerinin farklı kütle izotoplar ile kimyasal olarak etiketlenmiştir böylece iTRAQ (nispi ve mutlak miktar tayini için izobarik etiketi) kullanımını içerebilir; sisteinler farklı kütle izotopları ve ağır ve hafif su etiketleme ile etiketlenmiş sayede iCAT (izotop kodlu afinite etiketi).

Her durumda, bununla birlikte, tek bir şey akılda tutulması gerekmektedir. MS, sadece bir numunede mevcut olanı raporları, ve bu o noktaya o örnek up oldu her şeyin bir yansımasıdır. Her adımda veriminin maksimize ederken örnek işlemlerine en aza indirmek başarılı proteomik analizi için gereklidir.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone	Aldrich	195464
2-D Quantitation Kit	VWR (GE Healthcare)	80-6483-56
Albumin from bovine serum	Sigma	A7030
Ammonia Solution 25%	Merck	1.05432
Ammonium Bicarbonate	Sigma	A6141
Calcium Chloride	Sigma	C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate	Research Organics	1300C
Chloroform	BDH	10077.6B
di-sodium hydrogen phosphate	Merck	1.06580
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779
Formic Acid	Sigma	O6440
Glucose	Sigma	G6152
Glutamine-L	Sigma	G7513
Hepes (free acid)	Sigma	H3375
Iodoacetic acid free acid	Sigma	I4386
Lactic Acid	Sigma	L1750
Magnesium Chloride	Res. Org.	0090M
Methanol	Merck	10158.6B
Percoll (sterile)	VWR (GE Healthcare)	GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt	ThermoFisher Scientific (Pierce)	PIE78420
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Potassium Hydrogen Carbonate	Medical Store	CH 600
Sodium Bicarbonate	Sigma	S3817
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Sodium di-hydrogen phosphate	Merck	1.06346
Sodium hydrogen carbonate	BDH	10247.4V
Sodium Pyruvate	Sigma	S8636
Tris Ultra Pure Grade	Amresco (Astral)	AM0497
Trypsin Gold-Mass Spec Grade	Promega	V5280
Urea	Sigma	U5128
Zinc Chloride	Sigma	Z0173
0.4 mm polyethylene tubing	Goodfellow	ET317100
30 gauge needle	Terumo	NN2038R
3 mL syringe	Terumo	SS035
4.2 mm polyethylene tubing	Goodfellow	ET317640
Braided silk (5-0)	Dynek	CSS0100
Trichloroacetic acid	Sigma	299537
TiO2 beads (from disassembled column)	Titansphere	6HT68003
Eppendorf Tube	Eppendorf	22431081
C7B30	Sigma	C0856

Referanslar

Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. . Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. . The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).
Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. . The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).
Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).

Etiketler

Phosphopeptide Analysis Rodent Epididymal Spermatozoa Sperm Maturation Post-translational Modifications Protein Phosphorylation TiO2 Affinity Chromatography Mass Spectrometry Testis Epididymis Spermatozoon Motility Egg Recognition

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Baker, M. A., Hetherington, L., Weinberg, A., Velkov, T. Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa. J. Vis. Exp. (94), e51546, doi:10.3791/51546 (2014).