Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Gli spermatozoi sono abbastanza unico tra i tipi di cellule. Sebbene prodotta nel testicolo, sia la trascrizione del gene nucleare e la traduzione sono spenti una volta la cella rotonda pre-cursore comincia ad allungarsi e differenziarsi in ciò che è morfologicamente riconosciuto come uno spermatozoo. Tuttavia, lo spermatozoo è molto immaturo, non avendo capacità di motilità o riconoscimento uovo. Entrambi questi eventi si verificano una volta il transito spermatozoi un organo secondario noto come epididimo. Durante il passaggio ~ 12 giorni che ci vuole per una cella di sperma di passare attraverso l'epididimo, modificazioni post-traduzionali delle proteine esistenti svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione della cellula. Un aspetto importante di questa è fosforilazione proteica. Al fine di caratterizzare gli eventi di fosforilazione che si svolgeranno durante la maturazione degli spermatozoi, devono essere stabiliti due popolazioni di cellule di sperma puri e pre-frazionamento di fosfopeptidi. Utilizzando tecniche di lavaggio indietro, un metodo per l'isolamento di puro spermatozoi of alta qualità e la resa dei epididimi distali o caudale è delineato. Sono spiegati i passaggi per solubilizzazione, la digestione, e pre-frazionamento di fosfopeptidi spermatozoi attraverso TiO2 cromatografia di affinità. Una volta isolato, fosfopeptidi possono essere iniettati in MS per identificare entrambi gli eventi di fosforilazione di proteine su specifici aminoacidi e quantificare i livelli di fosforilazione che si svolgono durante i processi di maturazione degli spermatozoi.
Uscito dal testicolo, spermatozoi sono molto differenziati ancora notevolmente, queste cellule sono immature 1,2. Come tali, non hanno completa funzionalità, tra cui la possibilità di nuotare e si legano ad un ovocita 3. Anche se è necessaria ulteriore maturazione della cellula sperma, questo non può avvenire tramite percorsi canonici, poiché in questa fase del loro processo di differenziazione cellulare, sono incapaci di trascrizione genica e in seguito biosintesi delle proteine 4. È conferita la competenza biologica su spermatozoi che lasciano testicolo ed entrano una parte del sistema riproduttivo maschile noto come epididimo 5. L'epididimo è una stretta spirale, tubo altamente differenziato che collega i condotti efferenti (del testicolo) per le deferenti ed è presente in tutti i mammiferi maschi 6. Gli spermatozoi progressivamente acquisire il loro potenziale di concimazione durante la discesa epididimale, basandosi sull'ambiente luminale continua evoluzione che è created da parte delle cellule epiteliali dell'epididimo locali 7. Le varie attività secretoria e ri-assorbenti presenti nell'atto epididymal milieu di modificare lo sperma in sé, cambiando il suo proteine, carboidrati e lipidi composizione 6. L'importanza dell'epididimo, in particolare la regione iniziale 'caput' di questa struttura è stata esemplificata utilizzando tecniche chirurgiche legatura 8. Gli spermatozoi conservati all'interno del testicolo da efferente condotto legatura sono completamente privo di qualsiasi capacità di fecondare l'ovocita 9-11.
Oltre all'ambiente epididimale, trasduzione del segnale all'interno dell'opera spermatozoi al post-traslazione modificare il complemento spermatozoo esistente. Ad esempio, gli spermatozoi dai primi regioni dell'epididimo visualizzare diversi modelli di fosforilazione di proteine rispetto a queste ultime regioni 5,12. Questo non è sorprendente dal momento che ci sono grandi differenze nel capability dello sperma da queste regioni. Ad esempio, gli spermatozoi dei primi anni, caput epididimo sono immotilite. Al contrario, le cellule spermatiche della regione cauda subiranno avanti motilità progressiva volta posto in mezzo isotonico. Dato che le cellule spermatiche epididymal sono incapaci di de-novo biosintesi delle proteine, tutti i percorsi intrinseci che regolano la funzionalità degli spermatozoi deve avvenire attraverso modificazioni post-traduzionali (PTM). Quindi, è ovvio che la proteomica, e in particolare la ricerca di PTM, come la fosforilazione deve essere uno degli elementi principali, se vogliamo capire sperma maturazione delle cellule.
Un metodo alternativo per ottenere spermatozoi dalle epididymidies usare retro-backflush 13-16. Sebbene questa tecnica è certamente più tempo e richiede un maggior grado di abilità da parte dell'operatore, gli spermatozoi ottenuta costantemente dimostrare purezza superiore al 99,99%. Inoltre, a differenza di tutte le altre tecniche, spermatozoi can essere isolato in uno stato quiescente, rendendo possibile studiare come viene iniziata la motilità degli spermatozoi. Come preparazione del campione è l'aspetto più importante per l'analisi proteomica, l'isolamento degli spermatozoi è diventato uno degli aspetti più importanti di studi sperma-proteomica. Questo protocollo fornisce una spiegazione su come spermatozoi sono isolati dal epididimo cauda. In seguito a questo, la procedura di arricchimento 2 fosfopeptide TiO è delineato, con specifico riferimento su come estrarre peptidi dalle spermatozoi altamente differenziate. L'approccio MS può essere utilizzato per distinguere mutevoli fosfopeptidi se si dovesse confrontare la epididymal spermatozoi caudale in uno stato (immotile o non capacitati) ad un altro (mobili, capacitati, acrosoma reagito, etc.) rendendo questo un approccio potente per studiare sperma funzione.
I passaggi critici per il successo e riproducibile analisi proteomica di spermatozoi sono: 1) la purezza del materiale di partenza; 2) la rimozione dei sali e detergenti indesiderati; 3) denaturazione proteine per la loro estensione in modo da consentire tripsina per digerire un alto rendimento di proteine e 4) minimizzando campione movimentazione per ridurre la perdita di peptide.
Per backflush successo l'epididimo cauda, è essenziale per individuare la zona da cui spermatozoi uscirà. In caso di ratto e topo, questo è all'apice della zona concava, nel mezzo della regione caudale dell'epididimo (vedi figura 2A). Se uno viene ulteriormente verso i vasi deferenti, risciacquo è più facile e il tasso di successo è generalmente superiore. Tuttavia, questo ha la perdita di numero di spermatozoi. In alternativa, se si tenta di muoversi più prossimale al corpus, allora la quantità di pressione necessaria per spingere il spermatozoi indietro attraverso il epididymcondotti Al è spesso così alta, che danno ai epididimo avviene inevitabilmente.
Backflush dell'epididimo avviene tradizionalmente con acqua satura di olio minerale e una soluzione salina bilanciata nella siringa stessa come un mezzo per rimuovere gli spermatozoi 22-25. Entrambe le procedure sono potenzialmente problematici di LC-MS. In primo luogo, minerale rischia di bloccare le nano-C18 nano-colonne che sono essenzialmente utilizzati in tutto il mondo per l'analisi e la cura proteomica devono essere prese in modo che nessuno sia portato avanti nella procedura. In questo caso, non è possibile proseguire e il campione viene sostanzialmente perso. Questo può essere superato con l'uso di BWW o altre soluzioni saline bilanciate nella siringa, tuttavia, anche se questo è successo, presto riconosciuto che molti degli spermatozoi mobili diventano non appena la soluzione BWW entra in contatto e mescolato con il epididimale caudale cellule. Per aggirare questo problema semplicemente backflush gli spermatozoi con l'aria. Non solo è la quallità di spermatozoi paragonabile a quella dei metodi a base liquida, ma la quantità è identico.
Fosfoproteomica è forse uno dei pochi modi per stabilire quali vie di segnalazione si verificano in spermatozoi post-eiaculazione. Una delle principali vie che stiamo indagando è il processo di capacitazione. Gli spermatozoi deve sottoporsi "capacitazione" prima che sia in grado di legarsi ad un uovo. In pratica, questo è realizzato sostanzialmente incubando spermatozoi per un periodo di tempo (topo 40 min; ratto 1,5 ore; umana 3-24 ore) in soluzione BWW con albumina sierica. In precedenza, noi ed altri hanno dimostrato un ruolo per diverse chinasi coinvolte in capacitazione. Di interesse, la cancellazione della PKA μ II produrre topi i cui spermatozoi nuotare spontaneamente in vitro, ma non può subire iperattivazione 26. Quest'ultima è una caratteristica di capacitazione, per cui gli spermatozoi cambiare il loro modello di nuoto da una velocità elevata, bassa ampiezza, a un minimovelocità, ampiezza alta battuto frequenza. Abbiamo dimostrato chinasi a valle coinvolti in questo processo sono PP60-CSRC (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. È interessante notare che l'inibizione di SRC ferma capacitazione-dipendente fosforilazione della tirosina 13. Tuttavia, questo può essere superato con l'acido okadaico, suggerendo che SRC non è direttamente coinvolto nella insorgenza generale di fosforilazione della tirosina 29, ma possono disciplinare una fosfatasi 29. Il problema con l'utilizzo BWW come mezzo per forzare spermatozoi fuori dell'epididimo è che, una volta attivato, mouse spermatozoi richiedono soltanto circa 40 min a capacitate. Dato che l'isolamento di spermatozoi può prendere 5 min / mouse e spesso diversi topi sono utilizzati in un esperimento, allora spermatozoi sarà a diversi stadi di maturazione all'inizio dell'esperimento. Per ovviare a questo, la pressione dell'aria può essere utilizzato per spingere il spermatozoi dall'epididimo caudali in una cannula di vetro. Non solo tutte le inact spermaive ed essenzialmente come sarebbero trovate nell'ambiente caudale, rende possibile il confronto fosfoproteomica non mobili e mobile.
La gestione per fosfoproteomica campione deve essere ridotto al minimo quando si confrontano spermatozoi in due diversi stati funzionali. L'uso di metanolo cloroformio rispetto ad altri metodi tradizionali di proteine precipitazione 1) riduce la necessità di ulteriori fasi di lavaggio, 2) rimuove quasi tutte le tracce di sali e grassi e 3) ha una comprovata capacità di precipitare proteine poco abbondanti su TCA 19. Protein precipitazioni prima tripsina digestione è consigliato dal momento che non solo fa questo aiuto per denaturare proteine (che aiuta la digestione tripsina), ma rimuove molti dei metaboliti MS-compatibili presenti nella cellula.
Il confronto di fosfopeptidi sperma può essere fatto in diversi modi. Al livello di base, un semplice confronto della fosfopeptide identificato in un campione, a quella in un'altracampione nel processo noto come "conteggio spettrale" può essere fatto. Tuttavia la critica è stata in questo approccio fondamentalmente perché i primi studi di proteomica usavano basse repliche (per una discussione più vedere Lundren et al. 30). Un approccio più sofisticato è quello di esaminare l'intensità della massa genitore peptide e confrontarlo con gli altri campioni (di confronto libero-label). Nell'esempio illustrato nella figura 4, un peptide assente dal da non mobili (figura 4 in alto), ma presenti nella mobili (Figura 4 in basso) spermatozoi da m / z 650-670 può essere visto. Questo processo, denominato etichetta MS quantificazione libera è una strategia senza etichetta.
Una strategia alternativa comunemente usato per ridurre la quantità di piste richiesti per la quantificazione proteomica è utilizzare isotopi. Poiché la massa di un isotopo è diverso, lo spettrometro di massa può essere utilizzata per confrontare le intensità del Eluting peptidi. Tuttavia, a differenza di molti altri tipi di cellule, alcune etichettatura isotopica non può essere applicato a spermatozoi. Ad esempio, l'aggiunta di isotopi stabili (un isotopo pesante viene aggiunto un campione, mentre una versione più leggera viene aggiunto ad un altro) può essere utilizzato in coltura tissutale. Quando gli isotopi vengono incorporati nella proteina, un'analisi proteomica può essere eseguita combinando i due campioni (multiplazione). Tuttavia, nel caso di spermatozoi, ciò non può essere fatto, semplicemente in virtù del fatto che 1) marcatura isotopica richiede diversi passaggi (fino a 8) in coltura tissutale e 2) gli spermatozoi senza trascrizione genica nucleare e traduzione e quindi, essi non possono incorporare comunque isotopi in tutte le loro proteine. Un modo per aggirare questo è quello di ordinare i topi radiomarcati, tuttavia, questi sono notoriamente costosi. Un approccio alternativo è di utilizzare un tag chimica. Questo è stato fatto quando i topi non capacitati sono stati confrontati con i topi capacitati. In questo caso, un D 0 e D <sub> 3 -label stato utilizzato per distinguere tra un campione e l'altro nello spettrometro di massa 31. Altri approcci possono includere l'uso di iTRAQ (tag isobarica per la quantificazione relativa e assoluta), per cui lisine sono etichettati chimicamente con diversi isotopi di massa; iCAT (isotopo codificato tag affinità) per cui cisteine sono etichettati con diversi isotopi di massa e l'etichettatura di acqua pesante e leggero.
In ogni caso, comunque, una cosa deve essere tenuto a mente. La MS riporta solo ciò che è presente in un campione, e questo è un riflesso di tutto ciò che è accaduto a quel campione fino a quel momento. Minimizzare la manipolazione del campione, mentre massimizzando il rendimento ad ogni passo è necessario per un successo analisi proteomica.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
Chloroform | BDH | 10077.6B | |
di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
Formic Acid | Sigma | O6440 | |
Glucose | Sigma | G6152 | |
Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
Methanol | Merck | 10158.6B | |
Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
Urea | Sigma | U5128 | |
Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
C7B30 | Sigma | C0856 |