Two-Photon<em> In vivo</em> Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação
Özet
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
No córtex dos mamíferos, os neurônios formam redes extremamente complicadas e troca de informações nas sinapses. As alterações na concentração sináptica, bem como a adição / remoção de sinapses, ocorrem de uma forma dependente da experiência, fornecendo a base estrutural de plasticidade neuronal. Como componentes pós-sinápticas das sinapses excitatórias mais no córtex, espinhas dendríticas são consideradas como um bom indicador de sinapses. Tirar vantagens da genética e técnicas de rotulagem fluorescentes, neurônios individuais e suas estruturas sinápticas podem ser rotuladas no cérebro intacto. Aqui apresentamos um protocolo de imagem transcraniana por microscopia de varredura a laser de dois fótons de seguir fluorescente etiquetado espinhas dendríticas pós-sinápticos ao longo do tempo in vivo. Esse protocolo utiliza uma preparação diluída de caveira, que mantém o crânio intactos e evita efeitos inflamatórios provocados pela exposição das meninges e o córtex. Assim, as imagens podem ser adquiridas imediatamente após surgery é realizada. O procedimento experimental pode ser realizado repetidamente durante vários intervalos de tempo variando de horas a anos. A aplicação desta preparação também pode ser expandido para investigar diferentes regiões e camadas corticais, bem como outros tipos de células, em condições fisiológicas e patológicas.
Introduction
O córtex dos mamíferos participa em muitas funções do cérebro, desde o controle da percepção e movimento sensorial abstrair processamento de informação e cognição. Várias funções corticais construir sobre diferentes circuitos neurais, que são feitas de diferentes tipos de neurônios se comunicando e trocando informações nas sinapses individuais. A estrutura e função das sinapses são constantemente a ser modificados em resposta a experiências e patologias. No cérebro maduro, plasticidade sináptica toma a forma de ambas as mudanças de força e adição / remoção de sinapses, jogando um papel importante na formação e manutenção de um circuito neural funcional. As espinhas dendríticas são as componentes pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias no cérebro de mamíferos. O volume de negócios constante e alterações morfológicas de espinhos são acreditados para servir como um bom indicador de modificações nas conexões sinápticas 1-7.
Dois fótons micro varredura a laserscopy oferece penetração profunda através, preparações espessas e opacas baixo fototoxicidade, o que o torna adequado para imagens ao vivo no cérebro intacto 8. Em combinação com marcação fluorescente, dois fótons de imagem fornece uma ferramenta poderosa para espreitar para o cérebro vivo e siga reorganização estrutural nas sinapses individuais com alta resolução espacial e resolução temporal. Vários métodos têm sido usados para preparar os ratos para imagens ao vivo 9-13. Aqui, descrevemos uma preparação diluída crânio-in vivo de dois fótons de imagem para investigar a plasticidade estrutural das espinhas dendríticas pós-sinápticos no córtex mouse. Usando essa abordagem, os nossos estudos recentes têm representado uma imagem dinâmica de alterações da coluna dendríticas em resposta a habilidade motora aprendendo Com o aumento da disponibilidade de animais transgênicos com subconjuntos de neurônios marcados com fluorescência e rápido desenvolvimento de técnicas in vivo de rotulagem, procedimentos semelhantes descritos aqui também pode ser aplicado para investigaçõesoutros tipos de células e de te regiões corticais, combinadas com outras manipulações, bem como os utilizados em modelos de doenças 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para se obter uma preparação bem sucedida diluído-crânio, várias etapas deste protocolo são cruciais. 1) A espessura do crânio. O osso do crânio tem uma estrutura de sanduíche, com duas camadas de osso compacto de alta densidade e uma camada intermédia de osso esponjoso de baixa densidade. Embora o micro-broca de alta velocidade é adequado para a remoção das camadas exteriores do osso compacto e osso esponjoso, a lâmina microcirúrgica é ideal para o desbaste da camada interna do osso compacto. À medida …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos James Perna para a ilustração gráfica. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde Mental para YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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