Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Time-lapse de tejido vivo proporciona acceso visual a dinámicas relaciones estructura-función que no se puede apreciar en los preparativos fijos o que viven fotografiados en un solo punto en el tiempo. A menudo, sin embargo, la compensación para el acceso a la información temporal es una disminución en la resolución óptica. Altos objetivos de inmersión en aceite apertura numérica no son prácticos en los tejidos vivos debido a su estrecho rango de enfoque, dejando a la inmersión en agua o los objetivos secos como las únicas alternativas. Por otra parte, el aumento de la resolución proporcionada por la óptica confocal no puede ser utilizado en algunas preparaciones de vida debido a la fototoxicidad de los niveles relativamente altos de iluminación requerida ^1,2. Por último, mientras que varias técnicas ópticas en tiempo real o con lapso de tiempo están disponibles que ofrecen una mayor resolución, su aplicabilidad se limita a las elaboraciones en las estructuras de interés se puede colocar dentro de unos pocos cientos de nanómetros de objetivo ^1. El método descritohace uso de un equipo relativamente de bajo costo, es versátil, sin embargo, ofrece una resolución mejorada en comparación con las técnicas de time-lapse de uso común más. Está diseñado para su uso en laboratorios individuales, así como las instalaciones de formación de imágenes.

El método utiliza la microscopía de epifluorescencia convencional, combinado con una cámara digital sensible y con hardware diseñado para adquirir rápidamente los conjuntos de imágenes en momentos ligeramente diferentes planos focales (Z-pilas). Cada z-stack se deconvolved digitalmente para aumentar la resolución. Una característica de las imágenes en 3D de lapso de tiempo (4D) es un seguimiento preciso de los orgánulos u otras estructuras en movimiento. Si se configuran correctamente, estructuras proyectadas no salen fuera de foco, y el movimiento en las tres direcciones pueden ser observados y cuantificados. Por lo tanto es imposible que una estructura manchado a desaparecer en uno o más marcos de lapso de tiempo simplemente por la deriva por encima o por debajo de un plano focal estrecho. El método también sirve como una herramienta sensible para la evaluación de las interacciones y posible Fusión de las estructuras pequeñas. Epifluorescencia convencional o confocal de imágenes de estructuras cerca del límite de difracción (unos pocos cientos de nm) no confirman fusión aunque las imágenes fusionadas muestran la superposición de sus respectivas etiquetas ^3. Se sugiere la fusión, pero sigue siendo posible que los objetos están separados horizontalmente o verticalmente por una distancia que está por debajo del límite de difracción. Tres-o formación de imágenes de cuatro dimensiones, en contraste, permite ver los objetos en cada una de tres direcciones ortogonales. La aparición de la fusión en todos los tres puntos de vista aumenta el nivel de certeza. Y, en algunas preparaciones de vida, dirigió o movimiento browniano de objetos supuestamente fusionados proporciona una prueba más de que ambas etiquetas se mueven juntos en el tiempo. Por supuesto, cuando está cerca del límite de difracción del nivel de certeza en las estructuras exigentes de fondo, o demostrando que contienen dos tintes (de fusión), no es absoluta. Si, técnicas especializadas aplicables, tales como la fluorescencia de resonancia la transferencia de energía (FRET)^4, son más apropiados.