Fare Beyin<em> Ex Vivo</em> Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

1.. İsteğe bağlı: FBM Atraksiyon Testi için Affı-jel Heparin Boncuk (Jel Boncuk) hazırlayın NOT: eksplant prosedürü başlamadan önce en az 1 gün jel boncuk hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) bir silindir üzerine 20 dakika için steril PBS ile 100 ul jel heparin boncuk süspansiyonu yıkayın. 13000 x g, 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde Pellet boncuk. Steril PBS ekleyin ve yıkama işlemi 4x tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PBS kaldırmak ve solüsyon ile boncuk kapsayacak şekilde bakımı, tercih edilen bir yeniden birleştirici protein ihtiva eden bir steril çözelti, küçük bir hacim içinde boncuk ıslatın. Bu protokol daha önce yayımlanmış bir deney 16 üretmek için PBS içinde 100 ul / ng yeniden birleştirici insan VEGF165 kullanır. 4 ° C 'de bir silindir üzerinde 12 saat arasında, en az rekombinant protein çözeltisi ve 1 haftalık bir maksimum ile jel boncukları heparin inkübe 2. Kültür Ekle Kaplamas Arka beyin eksplantlar Corning kültürü üzerinde kültürlenmiştir, bir 8 um gözenek büyüklüğü ya da eşdeğer bir ekler ile ekler. Kültür uçlar da, damıtılmış su ile yıkandı, etanol ile sterilize edilmesi ve gerekli olana kadar% 70 etanol içinde saklanır verilen, protokolün tamamlanmasından sonra yeniden kullanılabilir. Not: Aşağıdaki adımlar, steril koşullar altında bir akış başlığı içinde yapılmalıdır. B27 (20 ul / ml) ile takviye edilmiş ortam Neurobasal oluşan eksplant kültür ortamı hazırlayın, glikoz (6 mg / ml) ve penisilin / streptomisin (5 ug / ml). Yıkama kültür 5 dakika ve akış kaputu altında 5-10 dakika boyunca kuru için steril PBS ile ekler. Bir 12well plakanın her oyuğuna ayrı ayrı bir kültür koyunuz. Not: ekler kuyunun içine sıkıca küçük bir itme gerekebilir. , Neuro temelli ortam içinde 10-20 ug / ml fare laminin ile kültür uçları Kapak ve 37 ° C,% 5 CO (bir doku kültürü inkübatörü içinde, koyun <sub> 2), 1 saat boyunca. Not: Kaplama eksplante gününde yapılmalıdır. 3. E11.5 fare embriyoları Hindbrains diseksiyonu Embriyonik günde bir etik onaylı prosedüre (E) 11.5 ile zamanlanmış hamile kadın fare itlaf ve buz L15 ortamı ile 100 mm plastik tabak embriyoları içeren rahim yerleştirin. Not: Tüm adımlar diseksiyon buz soğukluğunda L15 olarak gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon mikroskobu kullanılarak ve Dumont saatçi, embriyolar maruz rahim kas duvarı gözyaşı her embriyo bırakın, göbek bağını koparmak ve dikkatle sarısı kesesi kaldırmak, sayısı 5 forseps. Geniş çaplı bir açıklığı olan bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buz soğukluğunda L15 ile temiz bir plastik çanak içine her embriyo transferi. Dumont forseps kullanarak, sadece ön ayakları üzerinde embriyo başını kesmek. Deney embriyoların genotiplendirmesi gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için doku örnekleri toplamak (örneğin küçük piecyolk kesesi veya kuyruk ucu 16,20) e. Kadar baş sırt tarafını çevirin ve ince bir doku tabakası (Şekil 2B) ile kaplıdır 4. ventrikül, tanımlamak. Dikkatle roofplate delmek ve arka arka beyin ve omurilik üzerinde orta hat boyunca caudally bunu soyulmaya başlar ve rostrally Ortabeyin bitti. Beyin artık (Şekil 2C) maruz olmalıdır. Dikkatle kalan baş mezenşimi ve arka beyin (Şekil 2B) ve Pial tarafına bağlı herhangi meninks uzak kızdırmak. Beyin unfurls böylece orta beyin ve omurilik dokusu çıkarmak ve açık bir kitap hazırlanması (Şekil 2E) düz yalan olabilir. Geniş çaplı bir plastik pastör pipeti kullanılarak, buzla soğutulmuş L15 ihtiva eden bir 12-yuvalı plaka her kesilmiş arka beyin transferi ve hindbrains parçalara edilene kadar buz üzerinde saklayın. Geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, bir günah aktarmakbunu yaklaşık 100 ul L15 bir damlacık kadar açık bir kitap hazırlama, ventriküler tarafını tutarak boş bir çanak gle Beyin,. Aynı damlacık için kuluçkalanmıştır heparin jel boncuklarının birkaç mikrolitre aktarın. Not: boncuk büyüklükleri değişken olduğu için, bu yaklaşık 10 boncuk transferi ve daha sonra arka beyin içine nakil için optimal boyutunu seçmek tavsiye edilir. Arka beyin dokusunda küçük bir gözyaşı yapın ve dikkatli bir şekilde doku içine düşürülmesi, orta hat ve arka beyin yanal kenarı arasında yaklaşık yarım, R5 / 6 düzeyinde arka beyin dokusuna 1-3 jel boncukları eklemek ve böylece boncuk sadece arka beyin yüzeyinin altında konumlandırılmış. NOT: diseksiyon prosedür deneyimine bağlı olarak, 5-20 dakika / arka beyin arasında sürebilir, ve yavrular büyük ise uzun bir süre içinde streç olabilir, herhangi bir durumda, hindbrains iyi için 3 saat otopside daha artık kültür olmalıdır Sonuçlar. 4. BeyinEksplant Culture Inkübatör kültür ekler içeren plakasını sökün, laminin kaplama çözüm aspire. Kültür insert (Şekil 2G) üzerine kadar her Beyin ventral tarafı aktarmak, geniş çaplı bir plastik Pasteur pipet kullanarak, buz L15 ile dolu ayrı bir kültür çanak içine bir kültür koyunuz. Beyin uç zarı tamamen düz durmalıdır. Dikkatle çanak kültürü eki kaldırın ve aşırı sıvı kaldırmak için temiz doku kağıt üzerinde bunu birkaç kez hafifçe sürün. Bu işlem, arka beyin, düz ve açık bir kitap hazırlanmasında kültür inserte yapışmasını sağlar. Beyin yukarı kıvrılan varsa, onun doku geri dönüşümsüz birlikte büyümek olabilir. 500 ul önceden ısıtılmış kültür ortamı ile orijinal 12-plaka doldurun ve de bu geri yerleştirirler. Dikkatle Beyin şamandıra etmez sağlanması, sadece arka beyin karşılamak için başka bir medya 400-600 ul ile ses seviyesini ayarlamakzar kapatır. Bu yüzer ise, 4,4 adım ve arka beyin zara bağlı kalır kadar tekrar geri dönün. Bu aşamada, bu FBM nöronların göç üzerindeki etkisini incelemek için ortama ilgi biyolojik inhibitörlerinin ilave edilmesi de mümkündür. NOT: boncuk implante veya diğer tedavileri uygulamak, bu deney başarıyla kurulduktan emin olmak için her deneyde, normal büyüme koşulları altında en az 2 kontrol eksplantlarının korumak için tavsiye edilir. Bir doku kültürü kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO2) içinde 24-30 saat boyunca inkübe eksplantlar. 5. Beyin eksplant Wholemount Immunofluorescent Boyama Her kuyudan aspire ortam, PBS ile durulayın ve buz soğukluğunda% 4 formaldehit (PBS içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid, taze hazırlanmış ya da taze çözülmüş) içinde hafif bir çalkalama ile 4 ° C'de 2 saat boyunca düzeltin. Not: fiksasyon öncesi kültür Ovülden arka beyin kaldırmak için çalışmayıntamamlandı. 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle Dumont forseps kullanarak kültürü ekler gelen hindbrains soyun. Bazı eksplantlan kalkmasına zordur, ancak genellikle tekrar tekrar pipetle PBS kovma yoluyla hafif bir basınç uygulayarak kaldırılabilir. Immünfloresans etiketleme için 2.0 ml'lik yuvarlak dipli tüpler hindbrains aktarın. Yumuşak haddeleme ile,% 0.1 Triton X-100 (PBT) ihtiva eden PBS içinde oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hindbrains geçirgenliği. Yumuşak haddeleme ile% 10 ısıyla inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Isl1 için spesifik birinci antikor ile 5 gün boyunca 4 ° C'de nazik bir haddeleme ile inkübe eksplantlar,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT içinde 1:100 oranında seyreltildi. 15 dakika her biri için PBT ile RT 4x de eksplantlar yıkayın. Fluorofor ile konjüge edilmiş keçi anti-fare antikoru (örneğin, Alexa Fluor 488 keçi anti ile, 3 saat boyunca oda sıcaklığında hafif bir haddeleme ile eksplantların inkübeFare,% 1 ısı ile inaktive edilmiş normal keçi serumu ihtiva eden PBT) 1:200 seyreltilmiştir. Eksplantlar yumuşak haddeleme ile 15 dakika her biri için PBT ile oda sıcaklığında 4x yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 formaldehit içinde eksplantlar sonek. Eksplantlarının için bir cep oluşturmak için 3 siyah elektrik bandı katmanları ve bir neşter katmanlı bant küçük bir kare ile ÖTV ile bir cam slayt kapağı; alternatif olarak, bir depresyon cam slayt kullanın. Bir cebine Slowfade reaktif içinde her arka beyin montaj ve dikkatli bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak tuzak hava kabarcıkları ve görüntü kaçınarak, bir cam lamel ile kaplayın. Not: immun boyama için bir alternatif olarak, FBMS (örneğin Isl1 veya Phox2b) tanıyan riboprobes ile in situ hibridizasyon FBM nöronlar 16,21 görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Adımlar ve zamanlama Özeti ~ 14 gün: E11.25 gebelik elde Çiftleşmeyi Zamanlı İsteğe bağlı: Boncuk hazırlık (Protocol 1): embriyo öncesi izolasyon gününde ~ 2 saat, Kültür ekler ve medya (Protokol 2) hazırlayın: ~ 30 dk önce, embriyo izolasyon Embriyo izolasyon ve Beyin diseksiyonu (3,1-3,4 adımlar): ~ 10 dk / embriyo Beyin diseksiyonu (3,5-3,7 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin Eksplant prosedürü (3,8-3,9 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin İsteğe bağlı: boncuk implantasyon (3,10-3,11 adımlar): ~ 5-10 dakika / Beyin Eksplant kültür (adım 4.7): 24 saat Antikor boyama Fixation (adım 5.1): 2 saat Boyama prosedürü ve görüntüleme (Protokol 5): 5 gün