鼠标后脑<em>前体内</em>企业文化来研究面部Branchiomotor神经元迁移

1。可选：准备阿菲 – 凝胶肝素珠（胶珠）为富时大马景点含量注：在开始植程序之前准备凝胶珠至少1天。 20分钟的滚筒，在室温（RT）洗涤100μl的凝胶肝素珠悬浮液用无菌PBS。 丸粒珠在台式离心机5分钟，在13000×g下。加入无菌PBS和重复洗涤过程4倍。 最后一次洗涤后，除去PBS，浸泡珠子在小体积的含有精选的重组蛋白中的无菌溶液，小心地覆盖有孔玻璃珠与该溶液。该协议使用100纳克/微升重组人VEGF165在PBS重现以前发表的实验16。 孵育凝胶肝素珠最少12小时的重组蛋白质溶液和最多1周上的辊子在4℃下 2。文化插入的涂层s 后脑外植体康宁文化培养插入一个8微米孔径的大小，或等效的插入。培养插入可以在协议完成后，可以重复使用，只要它们用蒸馏水洗涤，消毒用乙醇和直到需要保存在70％乙醇中。 注意：下面的步骤应在无菌条件下进行，在一个流罩。 制备外植体的培养基包括补充有B27（20微升/毫升）的Neurobasal培养基中，葡萄糖（6毫克/毫升）和青霉素/链霉素（5微克/微升）。 洗涤培养插入用无菌PBS 5分钟，干燥的流罩下5-10分钟。 将一种文化中插入操作12well板的每一个人好。注：刀片可能需要一个小推，以适应紧紧地里去了。 覆盖培养插入10-20微克/毫升小鼠层粘连蛋白在Neurobasal培养基，并放置在一个组织培养箱（37℃，5％CO2 <sub> 2）1小时。注意：涂层应进行上explanting的日子。 3。从E11.5小鼠胚胎解剖Hindbrains的扑杀逾怀孕雌性小鼠与胚胎一天一个合乎伦理的程序（E）11.5，并把含有胚胎的子宫在一个100毫米的塑料培养皿用冰冷的L15培养基。 注意：所有的解剖步骤必须在冰冷L15来执行。 用解剖显微镜和杜蒙钳钟表匠5号，撕裂子宫肌壁，暴露的胚胎，释放每个胚胎，割断脐带，并小心地取出卵黄囊。 使用塑料巴斯德吸管用大口径开放，每个转移胚胎到一个干净的塑料盘用冰冷的L15。 使用杜蒙钳，杀头胚胎刚刚前肢上方。如果实验需要的胚胎的基因分型，收集组织样本进行基因组DNA的提取（ 例如小PIECË卵黄囊或尾尖16,20）的。 转动头部背侧，并确定4 个心室，其覆盖有薄的组织层（ 图2B）。小心刺破roofplate并开始尾端剥它拿走沿中线在后后脑和脊髓，并吻侧在中脑。后脑现在应该露出（ 图2C）。 仔细逗相差其余头间质和连接到后脑（ 图2D）的软膜侧的任何脑膜。 去除脑和脊髓组织，使后脑，随即渡过，并且可以在一个开放的书准备（ 图2E）平躺。 使用宽口塑料巴斯德吸管中，每个解剖后脑转移到一个12孔板中含有冰冷L15，并将它们存储在冰上直到所有hindbrains已被切开。 采用大口径塑料巴斯德吸管，转让罪GLE后脑到一个空盘子，保持一个开放的书准备，心室的一面朝上，在大约100微升L15液滴。 转让的培养肝素凝胶珠几微升到同一个液滴。注意：因为珠子的大小是可变的，最好是转大约10珠，然后选择用于移植的最佳大小到后脑。 做一个小撕裂在后脑组织并小心地插入1-3凝胶珠入后脑组织在R5 / 6的水平，对中线和后脑的横向边缘之间的半路上，降低他们进入组织，使胎圈正好位于后脑表面之下。 注：解剖过程可能需要5-20分钟/后脑之间，这取决于经验，可以舒展在较长时间内，如果胎大，在任何情况下，hindbrains应该在文化不长于3小时验尸好结果。 4。后脑植文化删除包含从孵化器中培养插入板，吸层粘连蛋白涂层解决方案。 放置1培养插入到一个单独的培养皿中充满了冰冷L15和，使用宽口塑料巴斯德吸管中，每个后脑腹侧转移到培养插入物（ 图2G）。后脑应该说谎完全平放在插入膜。 小心地从培养皿解除培养插管并轻轻拍上干净的纸巾数次以除去过量的液体。这个过程确保了后脑坚持在平坦，开阔的书准备文化插入。如果后脑蜷缩起来，它的组织可能会不可逆转地共同成长。 用500μl预热的培养基填充原来的12孔板，然后将插回这口井。仔细调整与另一400-600微升的媒体仅仅覆盖后脑的体积，确保后脑不浮离膜。如果它漂浮，则返回步骤4.4，并重复直到后脑仍然附着在膜上。 在此阶段，有可能感兴趣的生物抑制剂添加到媒体研究其对FBM神经元的迁移效果。 注意：如果植入珠或给予其他治疗方法，建议保持在每个实验中正常生长条件下至少有2个控制外植体，以确保实验已经成功建立。 培养外植体为24-30小时，在细胞培养箱（37℃，5％CO 2）。 5。后脑植平片免疫荧光染色从每个孔中吸出介质，冲洗的PBS中并在4℃下，在冰冷却的4％多聚甲醛（新鲜制备的或刚解冻的4％多聚甲醛溶于PBS）温和搅拌定为2小时。注意：不要尝试从固定前文化插入后脑删除已完成。 冲洗3次，用PBS。小心地从使用杜蒙镊子培养插入剥离hindbrains。有的外植体难以剥离，但是通常可以通过从移液管反复排出的PBS施加温和的压力被解除。 转移hindbrains至2.0圆底管免疫荧光标记。在含有0.1％的TritonX-100（PBT），轻轻压延室温（RT）的PBS中透化hindbrains 30分钟。 孵育1小时，在室温下在PBT中含有10％热灭活，轻轻压延正常山羊血清。 培养外植体，轻轻压延，在4℃下进行5天，具体为ISL1初级抗体，1:100稀释在PBT中含有1％热灭活的正常山羊血清。 在室温下用4倍的PBT，每次15分钟洗外植体。 培养外植体用温和的轧制在室温搅拌3小时以荧光团偶联的山羊抗小鼠抗体（ 例如的Alexa Fluor 488羊抗小鼠，1:200稀释）在PBT中含有1％热灭活的正常山羊血清。 洗植4倍于室温与PBT的15每个轻揉分钟。 postfix的外植体在4％多聚甲醛在室温30分钟。 盖上的黑色电工胶带3层和消费用手术刀分层磁带的小广场载玻片上创建一个口袋为外植体，或者，使用抑郁载玻片上。 装载每个后脑在SlowFade试剂成一个口袋里，盖上盖玻片，小心避开陷阱气泡和图像使用激光扫描共聚焦显微镜。 注意：作为一个替代的免疫染色，与核糖核酸探针能识别FBMS（即ISL1或PHOX2B）原位杂交可用于可视化FBM神经元16,21。 的步骤和时间安排概要 定时交配获得E11.25怀孕：〜14天可选：珠制剂（ProtocoL-1）：〜2小时，对前胚胎隔离的日子准备培养插入和媒体（协议2）：〜30分钟，前胚胎隔离胚胎分离及后脑清扫术（步骤3.1-3.4）：〜10分钟/胚胎后脑清扫术（步骤3.5-3.7）：〜5-10分钟/后脑植过程（步骤3.8-3.9）：〜5-10分钟/后脑可选：珠植入术（步骤3.10-3.11）：〜5-10分钟/后脑外植体培养（步骤4.7）：24小时固定的抗体染色（步骤5.1）：2小时染色过程和成像（协议5）：12天