Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

ETHIEK VERKLARING Menselijke en dierlijke monsters werden verwerkt volgens de richtlijnen van het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid, de wet 116/92 en de Richtlijn Europese Gemeenschappen 86/609/EEG van de Raad. 1. Monocyten Cell Cultures Cultuur humane THP-1-cellen in T-75 kolven met RPMI-1640 medium aangevuld met 10% humaan serum, 50 U / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine, 0,05 mM β-mercaptoethanol bij 37 ° C in 5% CO2. Split culturen wanneer samenvloeiing (elke 3-5 dagen). 2. Isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit Buffy Coats Voordat de isolatieprotocol, een oplossing van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2, 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 0,5% runderserumalbumine (BSA), toevoeging van 5 ml BSA stockoplossing aan 95 ml spoelbuffer (1: 20 verdunning). Ontgassen de buffer en houdt het koud (2-8° C). BELANGRIJK: Het niet ontgast de buffer kan resulteren in minder dan optimale resultaten, omdat bubbels de kolom isolatie (zie stap 3.2) kan blokkeren. Opmerking: anticoagulerende citrate dextrose formule-A (ACD-A) of fosfaat citraat dextrose (CPD) kan alternatief worden gebruikt. Omgekeerd kunnen andere albumine eiwitten of sera van andere soorten BSA vervangen. Niet buffers met Ca 2 + of Mg 2 + gebruiken. Verkrijgen buffycoats van gezonde donoren (20-60 jaar oud). Bereid 50 ml conische buizen voor dichtheidsgradiënt centrifugatie. Bepaal het aantal buizen die nodig is voor de verwerking van het bloed (elke buis kan 35 ml verdund bloed te verwerken) en voeg 15 ml Ficoll-Paque aan elke lege buis. Verdun 8 ml bloed met 24 ml PBS / BSA / EDTA-oplossing (1:04 verdunning). Laag het verdunde oplossing bovenop Ficoll-Paque (dichtheid = 1,077 g / ml) in elk van de 50 ml conische buizen voorzichtig. Gaan niet samenhet bloed en Ficoll-Paque. BELANGRIJK: Het mengen van het bloed en Ficoll-Paque vermijden, houdt u de buis in een hoek van 45 ° en laag langzaam het bloed mengsel. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Mononucleaire cellen (MNC) wordt bij het plasma-Ficoll-Paque-interface blijven terwijl granulocyten en erytrocyten sediment door hogere dichtheid bij de osmotische druk van Ficoll-Paque. Breng de interfase cellen (perifeer bloed mononucleaire cellen, PBMC) een nieuwe 50 ml buis gevuld met PBS / BSA / EDTA en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Was de pellet twee keer met PBS / BSA / EDTA bloedplaatjes te verwijderen. Spin bij 200 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Kweek van de cellen in compleet RPMI-1640 met 10% humaan serum en antibiotica of zich naar monocyten zuivering. 3. Zuivering van primaire monocyten uit PBMC Isoleer monocyten uit PBMC door magnetische kraal scheiding met behulp van Humeen Pan monocyten isolatie kit: Passeren cellen door een 30 um Nylon mesh (voorafscheider filters, 30 pm) om mogelijke celklonten verwijderen. Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer celsuspensie bij 300 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Aspireren supernatans volledig. Resuspendeer cel pellet in 30 ul PBS / EDTA / BSA buffer per 10 7 totaal cellen. Voeg 10 ul FcR Blocking Reagent per 10 7 totaal cellen. Voeg 10 ul van biotine-antilichaam cocktail per 10 7 totaal cellen. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C. Voeg 30 ul van buffer per 10 7 totaal cellen. Voeg 20 ul van anti-biotine microbolletjes per 10 7 totaal cellen. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij 2-8 ° C. Resuspendeer tot 10 8 cellen in 500 pi PBS / EDTA / BSA buffer. Magnetische gescheidenatie Dienovereenkomstig aan het totale aantal cellen, kiest u een geschikte MACS kolom en MACS Separator (zie MACS kolom datasheet). Plaats de kolom in het magnetisch veld van de MACS Separator. Kolom Bereid door spoelen met de juiste hoeveelheid PBS / EDTA / BSA buffer (MS kolommen: 500 pl; LS kolommen 3 ml). Opmerking: De kolommen zijn "flow stop" en niet drooglopen. Breng celsuspensie op de kolom. Verzamel doorstroom met ongelabelde cellen, die de verrijkte monocyten fractie. Kolom 3x wassen met PBS / EDTA / BSA buffer (500 ul voor MS en 3 ml voor LS per wasbeurt). Verzamel ongelabelde cellen die passeren, die de verrijkte monocytcellen, en toe te voegen aan de doorstroming van paragraaf 3.2.4. Opmerking: Was de kolom door het toevoegen van PBS / EDTA / BSA buffer porties alleen wanneer de kolom reservoir leeg is. (Optioneel) verwijder kolom uit deafscheider en plaats deze op een geschikte collectie buis. Pipetteer de buffer op de kolom (MS kolommen: 1 ml; LS kolommen: 5 ml). Onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde nonmonocyte cellen door stevig de zuiger in de kolom. Cultuur gezuiverde monocyten in volledige RPMI-1640 met 10% humaan serum en antibiotica. 4. Zuivering van primaire monocyten uit volbloed Zuiver monocyten uit volbloed gebruik volbloed monocyten isolatiekit volgende instructies van de fabrikant. 5. Nanodeeltjes Internalisatie in bloedleukocyten en Gezuiverd Monocyten Plate 5 x 10 5 cellen / ml (1 ml / putje) van het geïsoleerde PBMCs of gezuiverde CD14 positieve monocyten in een 12-wells plaat. Vortex FITC-SiO 2 nanodeeltjes stockoplossing en resuspendeer in compleet medium om een werkende concentratie van 100 nM. Voeg 10 ul van werken nanopartikel suspensie (100 nM) voor behandelde monsters een nanodeeltje eindconcentratie van 1 nM bereiken. Voeg hetzelfde volume compleet medium voor onbehandelde controles aan elk putje. Na 1 uur internalisatie verzamelen van de monsters in een 1,5 ml polypropyleen buis en centrifugeer ze gedurende 3 min bij 6000 xg bij kamertemperatuur. Was de pellet met 1 ml loopbuffer 3 min bij 6000 xg bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 200 gl loopbuffer. De cellen zijn nu klaar voor het lezen door flowcytometrie. 6. Isolatie van Primaire Mixed glialculturen (Zie Bertero et al.. 7) 7. Opnieuw platen een Mixed Glial Confluent Cell Culture Was een T-75 kolf eenmaal met 10 ml PBS (w / o Ca2 + / Mg2 +), voeg dan 10 ml Versene en incubeer bij 37 ° C gedurende 5-7 minuten. Pipetteer de supernatant en neer meerdere malen om de cellen los van de T-75 oppervlak en loscelaggregaten. Breng de celsuspensie in een 15 ml polypropyleen buis. Verzamel een kleine hoeveelheid celsuspensie om de cellen te tellen met een hemocytometer. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een eindconcentratie van 5 x 10 5 cellen / ml in gliale compleet cultuurmedium. Plaat 0,5 ml / putje in een 24-wells plaat en laat de cellen regelen voor 2-4 uur voor nanodeeltjes behandeling. 8. Nanodeeltjes Internalisatie in Microglia Voeg 500 ul volledig gliale cultuurmedium (voor onbehandelde controles) of 500 ui 2x Rhodamine-SiO2 nanodeeltjes suspensie volledig gliale kweekmedium (voor behandelde monsters) aan elk putje. Pipetteer de cellen om het detachement van nonrapid-hechtende cellen op de gekozen tijdstippen toe te staan ​​en ze te verzamelen in 2 ml polypropyleen buizen. Voeg 500 ulvan Versene aan elk putje en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5 minuten, vervolgens verwijder de overgebleven celfractie en laat elk monster met de overeenkomstige nonadhering cellen van de vorige stap. Centrifugeer de monsters gedurende 3 min bij 300 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 100 pl AutoMACS loopbuffer. 9. Kleuring met CD11b-VioBlue Voeg 10 ul van VioBlue-CD11b humaan / muizenantilichaam 100 ui celsuspensie (01:11 verhouding) in loopbuffer en incubeer 10 min bij 4 ° C. Voeg 1 ml loopbuffer en meng de celsuspensie. Centrifugeer elk monster gedurende 3 min bij 300 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100-150 ul van lopende buffer. Lees de monsters naar de cytometer (monsters worden bij 4 ° C tussen de laatste twee stappen). BELANGRIJK: voor het analyseren van de monsters, overgaan tot vergoeding van overlappende signalen in emissiespectra waargenomen tussen verschillende fluorochromen (fluorochroom-geconjugeerde nanodeeltjes of antilichamen). 10. Spectrale Spill overcompensatie Open de doos "Instrument instellingen" (aanwezig in alle instrument softwareprogramma's). Opmerking: Als u een ander instrument van de ene gerapporteerd in de Material Table, verwijzen wij u naar het instrument specifieke handleiding voor de verwerving details. Acquire onbehandelde monster (zonder nanodeeltjes) bij lage vloeibare snelheid (indien toegestaan ​​door het instrument). Tijdens de overname, met de hand naar voren te passen en kant verstrooiing (FSC en SSC, respectievelijk) door de spanning kanalen. Opmerking: Wijzig de as schalen SSC en FSC om optimaal te visualiseren de volledige celpopulatie in de plot. Een instrument waarin sjabloon voor elk celtype van belang kan worden gemaakt, opgeslagen en gebruikt voor toekomstige acquisities. Open de specifieke"Regio" tab in de software. Teken een geschikte groot gebied ("gate") rond de gewenste populatie. Opmerking: internalisatie van nanodeeltjes induceert een SSC verschuiving van de cellen. Als het hek te dicht wordt beperkt in de celpopulatie, de verkregen gegevens waarschijnlijk missen een deel van de cellen te detecteren. Gebruik twee ongekleurde monsters, een voor gebruik als blanco monster en een vergoeding tegen PI kleuring (optioneel), een enkel gekleurd monster met de juiste fluorochroom fluorescentie voor elk kanaal te compenseren. Opmerking: Gebruik een andere 1,5 ml monsterbuis voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam voor gebruik in het experiment etiket. Open het tabblad "Compensatie" in het vak "Instrument instellingen". Verhogen of de compensatie factor tijdens de overname te verlagen totdat de fluorescentie-intensiteit in de spill-kanaal is ongeveer hetzelfde voor de fluorchroom postieve en negatieve bevolking. Acquire-nanodeeltjes behandelde monsters na de compensatie is aangepast.