La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub> 35-55</sub>) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones
Özet
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.
Abstract
La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante neuroinflamatoria crónica del sistema nervioso central con un fuerte componente neurodegenerativo. Mientras que la etiología exacta de la enfermedad todavía no está claro, se cree que los linfocitos T autorreactivos a jugar un papel central en su fisiopatología. Tratamiento de la EM es sólo parcialmente eficaz hasta el momento y los esfuerzos de investigación continúe ampliando nuestro conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más común para MS compartir muchas características clínicas y patofisiológicas. Hay una amplia diversidad de modelos de EAE que reflejan diferentes aspectos clínicos, inmunológicos e histológicos de la EM humanos. EAE activamente inducida en ratones es el modelo inducible más fácil con resultados robustos y reproducibles. Es especialmente adecuado para la investigación de los efectos de las drogas o de determinados genes mediante el uso de ratones transgénicos impugnadas por Neurol autoinmunenflammation. Por lo tanto, los ratones son inmunizados con homogeneizado de SNC o péptidos de proteínas de la mielina. Debido a la baja potencial inmunogénico de estos péptidos, se utilizan adyuvantes fuertes. EAE susceptibilidad y fenotipo depende del antígeno elegido y la tensión de los roedores. C57BL / 6 ratones son la cepa utilizada para la construcción de ratón transgénico y responden entre otras a la mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG). El MOG epítopo inmunogénico 35-55 se suspende en adyuvante completo de Freund (CFA) antes de la inmunización y la toxina pertussis se aplica en el día de la inmunización y dos días más tarde. Los ratones desarrollan un "clásico" EAE monofásico autolimitada con parálisis fláccida ascendente dentro de 9-14 días después de la inmunización. Los ratones son evaluados diariamente utilizando un sistema de puntuación clínica de 25 a 50 días. Se discuten las consideraciones especiales para el cuidado de los animales con EAE, así como las posibles aplicaciones y limitaciones de este modelo.
Introduction
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria desmielinizante crónica del sistema nervioso central en el que la destrucción de oligodendrocitos y neuronas resultados en los síntomas clínicos heterogéneos y acumulación. MS es considerado como un trastorno autoinmune prototípica del sistema nervioso central (SNC) y se han desarrollado modelos animales para arrojar luz sobre su compleja patogenia. Por otra parte, las terapias actuales sólo son parcialmente eficaces y orientados principalmente a la fase inflamatoria de la enfermedad, mientras que el componente neurodegenerativo es, probablemente, el mayor reto para el futuro terapéutico se acerca 1,2.
Mientras que la etiología exacta de la enfermedad todavía no está claro, se supone que una reacción autoinmune contra epítopos en la vaina de mielina de los axones en el SNC para provocar la aparición de la enfermedad. La desregulación del sistema inmune, la vulnerabilidad genética y los factores ambientales (por ejemplo, las infecciones, la vitamina D) se cree queaspectos centrales de influencia de los mecanismos fisiopatológicos de la MS.
Tres tipos diferentes de modelos animales se han establecido actualmente para la exploración de los patrones patológicos de MS: modelos virales como el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV), los modelos inducidos por agentes tóxicos como cuprizone y, finalmente, las diferentes variantes de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 3, 4. Aunque todos ellos imitan las características de la EM, difieren enormemente en las características patológicas subyacentes como la participación del sistema inmune adaptativo. EAE es el modelo animal más común, ya que es especialmente útil para investigar las vías neuroinflamatorios ya menudo sirve como un modelo de "prueba de principio" para la eficacia de nuevas estrategias de tratamiento 5,6. La EAE puede ser inducida en muchos animales diferentes (por ejemplo, ratones, ratas, miniswine, cobayas, pollos, o primates). Sin embargo, los ratones se han convertido en los más ampliamente utilizar especies que es al menos en parte,a ampliar el repertorio de transgénicos sofisticados o ratones knockout 7.
La fisiopatología de la EAE se basa en la reacción del sistema inmune contra antígenos específicos del cerebro. Esta reacción induce la inflamación y la destrucción de las estructuras en libros de antígeno, lo que resulta en características neurológicas y patológicos comparables que los observados en pacientes con EM. Tres enfoques diferentes se pueden distinguir: EAE activamente inducida (EAEa; inmunización activa), de forma pasiva transferidos EAE (peae; transferencia de células encefalitogénicas de un animal inmunizado), y los modelos más recientemente espontáneas EAE ratón (SEAE), que permiten el estudio de enfermedades autoinmunes mecanismos sin manipulación exógena. El modelo más sencillo es inducible EAEa en ratones que producen en resultados rápidos y robustos. Este modelo es considerado como el "estándar de oro" de los modelos animales neuroinmunológicas por muchos investigadores en el campo 8.
Para EAEa de inducción, el animalse inmuniza con una inyección subcutánea de una emulsión que consiste en el antígeno elegido y completar adyuvante de Freund (CFA) acompañado de una inyección intraperitoneal de la toxina pertussis en el día de la inmunización y dos días más tarde. En consecuencia, los linfocitos T específicas para la mielina se activan en la periferia y migran en el SNC a través de la barrera hematoencefálica. A la entrada en el SNC, las células T se vuelven a activar por las células locales e infiltrantes presentadoras de antígeno resultantes en la posterior cascadas inflamatorias, la participación de otras células tales como monocitos o macrófagos y, finalmente, en la desmielinización y la muerte celular axonal 9. Dependiendo del protocolo de inmunización y combinación de cepa de ratón (por ejemplo, ratones C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) y el antígeno (por ejemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG), proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica de mielina (PLP)), la enfermedad Por supuesto se puede tomar un curso progresivo o recurrente aguda, crónica enfermedad en remisión.
<p class= "Jove_content"> ratones C57BL / 6 se han convertido en la cepa más comúnmente utilizado para ratones transgénicos construcción y una multitud creciente de knockout o ratones transgénicos está disponible. Se describen un protocolo para la inmunización de ratones C57BL / 6 con MOG 35-55 péptido 10 que resulta en una EAE monofásico con primeros síntomas después de 9-14 días, máximo enfermedad alrededor de 3-5 días después de la aparición de la enfermedad y la recuperación de los síntomas lenta y parcial en los próximos 10-20 días. A medida que el potencial inmunogénico de MOG 35-55 péptido por sí sola no es suficiente para inducir la enfermedad, adyuvantes tales como CFA son necesarios. Se supone, que los componentes de CFA activan los fagocitos mononucleares que inducen la fagocitosis de estas moléculas y la secreción de citoquinas. Esto da como resultado la prolongación de la presencia de antígenos y un transporte más eficiente de estos para el sistema linfático. La inducción de EAE es facilitado por la aplicación de la toxina de pertussis (PT), que ha sido sugerido entre otros para modularla barrera sangre-cerebro y el propio 11 de respuesta inmunológica. Después de la inducción de la enfermedad, la atención especial se debe tomar para la evaluación diaria de los ratones para los síntomas de la enfermedad.Protocol
Representative Results
Discussion
Una multitud de diferentes modelos de EAE con protocolos de inmunización activa se ha descrito en las últimas décadas. Mientras que los modelos de rata han sido ampliamente utilizados hasta hace poco, los ratones son ahora el organismo modelo más popular para la investigación de EAE. Este desarrollo es, entre otros, debido a la amplia y creciente repertorio de ratones transgénicos disponibles. La inmunización de ratones C57BL / 6 con MOG 35-55 péptido es uno de los modelos más ampliamente distribuida de EAE y puede ser considerado como un modelo fiable, reproducible y animal-así de usar. En muchos laboratorios neuroinmunológicas, MOG 35-55 EAE inducida se ha establecido como el modelo de elección mientras se utilizan otros modelos de EAE para las preguntas experimentales más específicos.
Un punto crítico a considerar es la planificación de los parámetros experimentales para asegurar que los experimentos de EAE se realizan metodológicamente correcta. Por la validez interna, se recomienda anotar cegada de síntomas de la enfermedad. Expergrupos imental debe ser la edad, el peso y el sexo con ajuste y los ratones deben ser asignados al azar a grupos de tratamiento. Los experimentos siempre se debe realizar en cumplimiento de las normas de bienestar animal. Estudios de EAE son a menudo de poca potencia y no toman en cuenta los errores estadísticos de tipo II. Por lo tanto, antes de los experimentos, se deben realizar los cálculos del tamaño de la muestra. Tamaño de los grupos necesarios dependen de la magnitud del efecto esperado. Consulta a un experto para el análisis estadístico podría considerarse antes de iniciar los experimentos de EAE.
Algunas limitaciones del protocolo deben mantenerse en mente. Lo más importante, la interpretación de los datos de EAEa se ve comprometida por el modo de inmunización con el uso de adyuvante y la tos ferina toxina que tiene tanto una influencia adicional en la reacción inmunológica. También se debe considerar que el modelo MOG 35-55 EAE muestra principalmente una célula T CD4 + impulsado respuesta inmunológica. Células T CD8 + y las células B jueganun papel menos prominente y protocolos alternativos deben ser considerados al tratar estos tipos de células. El curso de la enfermedad esperada es aguda, monofásica y autolimitada. Alternativamente, un curso de la enfermedad de recaída-remisión se puede conseguir también en los modelos de EAE alternativos. Una limitación importante adicional del protocolo es un cierto sesgo hacia el componente inmunológico de la fisiopatología de MS. Durante los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que la EM tiene un fuerte componente neurodegenerativo. La muerte de los oligodendrocitos y neuronas resultados en una acumulación progresiva de déficits neurológicos. Hay que tener en cuenta que el modelo de EAE puede no estar totalmente adecuado para abordar las cuestiones relativas a los mecanismos neurodegenerativos experimento de la inflamación autoinmune. Modelos animales alternativos con un enfoque en la patología del SNC pueden ser considerados – por ejemplo, el modelo cuprizone que compromete desmielinización tóxicos sin la participación del sistema inmune periférico.
El protocolo descrito puede considerar como un modelo experimental neuroinmunológicas básica y puede ser modificado para otras aplicaciones. El procedimiento experimental descrito anteriormente puede aplicarse fácilmente a otros protocolos de EAE por diferentes cepas de ratones o el tipo y la cantidad de proteína (por ejemplo, usar PLP139b151 péptido y ratones SJL para un curso de la enfermedad EAE recurrente-remitente, que es especialmente adecuado para la evaluación terapéutica efectos sobre las recaídas). El protocolo descrito también puede utilizarse para experimentos de transferencia adoptiva (pasiva EAE). En este modelo, ratones C57BL / 6 se inmunizan ratones con MOG 35-55 péptido y CFA como se describió anteriormente. Por el contrario, no se requiere la toxina pertussis. Después de 7-15 días, los bazos o ganglios linfáticos se aislaron y las células inmunes se volvieron a estimular in vitro con péptido MOG 35-55 y diversas citocinas antes de la transferencia a un nuevo grupo de ratones C57BL/6se. Estos ratones receptores desarrollan EAE unos pocos días antes que en clasinmunización SICAL. condiciones in vitro se pueden variar para las cuestiones inmunológicas específicas (por ejemplo, la polarización en T H 1 o células TH17).
A veces, la incidencia de la enfermedad baja o síntomas débiles podrían ser un desafío experimental. Algunas recomendaciones para la resolución de problemas son:
– Gravedad de la enfermedad se puede variar con diferentes cantidades de péptido / ratón.
– La concentración óptima CFA puede variar de 1-5 mg / ml. Considere la posibilidad de una titulación de CFA al establecer los experimentos. Por favor, consulte las directrices respectivas del cuidado de los animales institucional y el empleo Comisión respectiva para concentraciones CFA permitido tantas regulaciones prohíben las concentraciones exceden CFA 2 mg / ml.
– Diferentes métodos se describen para la preparación de la emulsión. Los métodos alternativos tales como vórtex durante 1 hora o ultrasonidos podrían considerarse si el pobre emulsificación se considera como posibfuente de error le.
– La edad, el género, la estación del año y de las condiciones ambientales dentro de las instalaciones de animales son factores importantes que influyen en la susceptibilidad EAE. Asimismo, debe asegurarse de que las condiciones son comparables entre experimentos independientes.
Como se describió anteriormente, el protocolo mencionado se puede utilizar como punto de partida para los experimentos de EAE adoptivos. Este modelo es especialmente adecuado para la separación de efectos periféricos y del sistema nervioso central de un fenotipo genético (por ejemplo, mediante la transferencia de células knockout encefalitogénicas en ratones receptores de tipo salvaje) y para preguntas inmunológicos específicos como el fenotipo de las células transferidas se puede caracterizar completamente. El último avance en la investigación de EAE en los últimos años son receptores de las células T de ratones transgénicos. Estos ratones desarrollan síntomas de la EAE de forma espontánea y sin influencia externa eludir el problema de la inoculación adyuvante. Sin embargo, este modelo requiere grandes cantidades de animales para breeding para asegurar tamaños de los grupos suficientes. Evaluación de ratones knockout requiere cruzamiento antes de los experimentos de EAE en contraste con EAEa. Como cada ratón desarrolla síntomas de la enfermedad en un día diferente, la evaluación de nuevas sustancias puede ser bastante complicado. Por lo tanto, el valor de EAEa clásica para neuroinmunológicas permanece sin respuesta.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) Münster (SEED 03.12, SB).
Materials
| Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
| MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
| Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
| Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
| Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
| Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
| Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
| M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |
Referanslar
- McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
- Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
- vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
- Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
- Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
- Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
- Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist’s magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).
