Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub> 35-55</sub>) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6
Özet
Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.
Abstract
La sclérose en plaques est une maladie neuro-inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central avec une forte composante neurodégénérative. Bien que l'étiologie exacte de la maladie est encore peu claire, les lymphocytes T auto-réactifs sont supposés jouer un rôle central dans sa physiopathologie. Traitement de la SP n'est que partiellement efficace à ce jour et les efforts de recherche de continuer à développer nos connaissances sur la physiopathologie de la maladie et de développer de nouvelles stratégies de traitement. Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal le plus commun pour MS partage de nombreuses caractéristiques cliniques et physiopathologiques. Il ya une grande diversité de modèles EAE qui reflètent différents aspects cliniques, immunologiques et histologiques de MS humaines. EAE activement induite chez la souris est le modèle inductible plus facile avec des résultats robustes et reproductibles. Il est particulièrement adapté pour étudier les effets des médicaments ou de gènes particuliers en utilisant des souris transgéniques contestées par neuroi auto-immunenflammation. Par conséquent, les souris sont immunisées avec des homogénats du système nerveux central ou des peptides de protéines de la myéline. En raison du faible potentiel immunogène de ces peptides, des adjuvants puissants sont utilisés. EAE sensibilité et phénotype dépend de l'antigène choisi et de la souche de rongeur. Souris C57BL / 6 sont la souche utilisée pour la construction de souris transgéniques et de répondre entre autres à la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG). L'épitope immunogène MOG 35-55 est mis en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (CFA) avant l'immunisation et la toxine pertussis est appliqué sur le jour de la vaccination et deux jours plus tard. Souris développent une EAE monophasique auto-limitée "classique" avec paralysie flasque ascendante dans 9-14 jours après la vaccination. Les souris sont évalués quotidiennement en utilisant un système de notation clinique pour 25-50 jours. Considérations particulières pour la prise de soin des animaux avec EAE ainsi que les applications et les limites potentielles de ce modèle sont discutées.
Introduction
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, dans lequel la destruction des neurones et des oligodendrocytes conduit à des symptômes cliniques hétérogènes et d'accumulation. MS est considérée comme une maladie auto-immune prototype du système nerveux central (SNC) et des modèles animaux ont été développés pour faire la lumière sur sa pathogénie complexe. En outre, les traitements actuels ne sont que partiellement efficaces et visent principalement la phase inflammatoire de la maladie tandis que la composante neurodégénérative est probablement le principal défi pour l'avenir thérapeutique des approches 1,2.
Bien que l'étiologie exacte de la maladie est encore peu clair, une réaction auto-immune contre des épitopes sur la gaine de myéline des axones dans le SNC est supposée provoquer l'apparition de la maladie. Le dérèglement du système immunitaire, la vulnérabilité génétique et des facteurs environnementaux (par exemple, les infections, la vitamine D) sont soupçonnés d'aspects centraux de l'influence des mécanismes physiopathologiques de la SEP.
Trois types de modèles animaux différents sont actuellement mis en place pour l'exploration de modèles pathologiques de MS: modèles viraux comme le virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV), les modèles induits par des agents toxiques comme cuprizone, et enfin les différentes variantes de l'encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) 3, 4. Bien que tous imitent fonctionnalités de MS, ils diffèrent énormément dans les caractéristiques pathologiques sous-jacents tels que l'implication du système immunitaire adaptatif. EAE est le modèle animal le plus commun, car elle est particulièrement utile pour étudier les voies neuro-inflammatoires et sert souvent de modèle "preuve de principe" pour l'efficacité de nouvelles stratégies de traitement 5,6. EAE peut être induite chez de nombreux animaux différents (par exemple, les souris, les rats, miniswine, cochons d'Inde, des poulets, ou de primates). Cependant, les souris sont devenues les espèces les plus largement utiliser ce qui est au moins en partie en raisond'élargir le répertoire de transgéniques sophistiquées ou des souris knock-out 7.
La physiopathologie de l'EAE est basé sur la réaction du système immunitaire contre des antigènes spécifiques de cerveau. Cette réaction provoque l'inflammation et la destruction des structures conductrices de l'antigène, ce qui entraîne des caractéristiques neurologiques et pathologiques comparables qui celles observées chez des patients atteints de SEP. Trois approches différentes peuvent être distinguées: EAE activement induite (æÆ; immunisation active), transmis passivement EAE (peae, le transfert de cellules encéphalitogènes d'un animal immunisé), et les modèles plus récemment spontanées EAE de souris (SEAE), qui permet l'étude des auto-immune mécanismes sans manipulation exogène. Le plus simple modèle inductible est æÆ chez les souris produisant des résultats rapides et robustes. Ce modèle est considéré comme le «gold standard» de modèles animaux neuroimmunologiques par de nombreux chercheurs dans le domaine 8.
Pour æÆ induction, l'animalest immunisé avec une injection sous-cutanée d'une émulsion comprenant de l'antigène choisi et les remplir des adjuvants de Freund (CFA), accompagnés par une injection intrapéritonéale de toxine de la coqueluche, le jour de la vaccination et deux jours plus tard. Par conséquent, les lymphocytes T spécifiques de la myéline sont activés dans la périphérie et migrent dans le SNC à travers la barrière sang-cerveau-barrière. Lors de l'entrée dans le système nerveux central, les cellules T sont réactivés par des cellules présentatrices d'antigène et d'infiltration locale résultant en subséquente cascades inflammatoires, l'implication d'autres cellules telles que les monocytes ou les macrophages et par la suite dans la démyélinisation et la mort cellulaire axonal 9. En fonction du protocole d'immunisation et de combinaison de souche de souris (par exemple, des souris C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) et d'antigène (par exemple la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG), la protéine basique de la myéline (MBP), la myéline protéine protéolipidique (PLP)), la maladie cours peut suivre un cours aiguë, chronique progressive ou récurrente maladie de versement.
<p class= "Jove_content"> souris C57BL / 6 sont devenus la souche la plus couramment utilisée pour la construction des souris transgéniques et une multitude croissante des huitièmes de finale ou des souris transgéniques est disponible. Nous décrivons ici un protocole pour l'immunisation des souris C57BL / 6 avec MOG 35-55 peptide 10 qui se traduit par une EAE monophasique avec des premiers symptômes après 9-14 jours, au maximum de la maladie environ 3-5 jours après l'apparition de la maladie et la récupération lente et partielle symptôme au cours des 10-20 prochains jours. Comme le potentiel immunogène de peptide MOG 35-55 seule n'est pas suffisante pour induire la maladie, des adjuvants tels que CFA sont nécessaires. On suppose que les composantes du CFA activer des phagocytes mononucléaires induisant la phagocytose de ces molécules et la sécrétion de cytokines. Il en résulte dans le prolongement de la présence d'antigènes et un transport plus efficace de celles-ci au système lymphatique. EAE induction est facilitée par l'application de la toxine de pertussis (PT) qui a entre autres été proposé de modulerla barrière hémato-encéphalique et la réactivité immunologique se 11. Après l'induction de la maladie, une attention particulière doit être prise pour l'évaluation quotidienne de la souris pour les symptômes de la maladie.Protocol
Representative Results
Discussion
Une multitude de différents modèles de EAE avec des protocoles d'immunisation active a été décrite au cours des dernières décennies. Alors que les modèles de rats ont été largement utilisés jusqu'à récemment, les souris sont maintenant l'organisme modèle le plus populaire pour la recherche EAE. Cette évolution est notamment due au répertoire large et de plus en plus de souris transgéniques disponibles. L'immunisation de souris C57BL / 6 avec MOG 35-55 peptide est l'un des modèles les plus largement distribués EAE et peut être considéré comme un modèle animal du puits à usage fiable, reproductible et. Dans de nombreux laboratoires neuroimmunologiques, MOG 35-55 EAE induite est établi comme le modèle de choix tandis que d'autres modèles EAE sont utilisés pour des questions plus spécifiques expérimentales.
Un point essentiel à considérer est la planification des paramètres expérimentaux pour s'assurer que les expériences EAE sont effectuées méthodologiquement correcte. Pour la validité interne, la notation en aveugle des symptômes de la maladie est fortement recommandée. Experiencesgroupes imental devraient être l'âge, le poids, le sexe et appariés et souris doivent être répartis de façon aléatoire à des groupes de traitement. Les expériences doivent toujours être effectuées en conformité avec la réglementation de protection des animaux. Études EAE sont souvent de faible puissance et ne prennent pas en compte les erreurs statistiques de type II. Par conséquent, avant d'expériences, calcul de la taille de l'échantillon doivent être effectués. La taille des groupes nécessaires dépendent de la taille de l'effet attendu. Consultation d'un expert pour l'analyse statistique pourrait être considéré avant de commencer les expériences EAE.
Certaines limitations du protocole doivent être gardés à l'esprit. Plus important encore, l'interprétation des données aeae est compromise par le mode d'immunisation avec l'utilisation de l'adjuvant et de la toxine pertussis qui ont à la fois une influence supplémentaire sur la réaction immunologique. Il convient également de considérer que le modèle MOG 35-55 EAE montre principalement une cellule T CD4 + conduit réponse immunologique. Cellules T CD8 + et les cellules B jouentun rôle moins important et d'autres protocoles doivent être considérés lors aborder ces types cellulaires. L'évolution de la maladie est aiguë attendue, monophasique et auto-limitée. Alternativement, une évolution de la maladie récurrente-rémittente peut également être réalisée dans des modèles EAE alternatives. Une autre limite importante de ce protocole est d'une certaine préférence pour la composante immunologique de la physiopathologie MS. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que MS a une forte composante neurodégénérative. La mort des oligodendrocytes et neurones entraîne une accumulation progressive des déficits neurologiques. Il doit être pris en compte que le modèle EAE peut ne pas être entièrement adapté pour répondre aux questions d'expérimentation concernant les mécanismes de neurodégénératives de l'inflammation auto-immune. Modèles animaux de substitution avec un accent sur la pathologie du système nerveux central peuvent être considérées comme – par exemple le modèle de cuprizone qui compromet démyélinisation toxique sans implication du système immunitaire périphérique.
Le protocole décrit à être considéré comme un modèle expérimental neuroimmunological de base et peut être modifiée pour d'autres applications. La procédure expérimentale décrite ci-dessus peut être facilement appliquée à d'autres protocoles EAE par différentes souches de souris ou le type et la quantité de protéines (par exemple, utiliser PLP 139-151 peptide et souris SJL pour une évolution de la maladie EAE récurrente-rémittente qui est particulièrement adapté pour l'évaluation thérapeutique effets sur les rechutes). Le protocole décrit peut également être utilisé pour des expériences de transfert adoptif-EAE (passive). Dans ce modèle, les souris C57BL / 6 sont immunisées avec le peptide MOG 35-55 et CFA comme décrit ci-dessus. En revanche, la toxine de pertussis n'est pas nécessaire. Après 7-15 jours, les rates ou de ganglions lymphatiques sont isolées et les cellules immunitaires sont restimulées in vitro avec le peptide MOG 35-55 et diverses cytokines avant le transfert dans un nouveau groupe de souris C57BL/6se. Ces souris receveuses développer EAE quelques jours plus tôt que sur clasvaccination sique. Dans des conditions in vitro peuvent être modifiés pour des questions immunologiques spécifiques (par exemple, la polarisation en T H 1 ou T H 17 cellules).
Parfois, l'incidence de la maladie est faible ou symptômes faibles pourraient être un défi expérimental. Quelques recommandations pour le dépannage sont:
– Gravité de la maladie peut varier avec différentes quantités de peptide / souris.
– Concentration optimale CFA peut varier de 1 à 5 mg / ml. Considérons un titrage de CFA lors de l'établissement des expériences. S'il vous plaît se référer aux lignes directrices respectives de la protection des animaux et l'utilisation comité respectif pour des concentrations CFA admis que de nombreux règlements interdisent concentrations dépassant CFA 2 mg / ml.
– Différentes méthodes sont décrites pour la préparation de l'émulsion. Des méthodes alternatives comme vortex pendant 1 heure ou ultrasons pourraient être envisagées si mauvaise émulsification est considéré comme possibSource d'erreur LE.
– Âge, le sexe, la saison de l'année et les conditions environnementales au sein de l'animalerie sont des facteurs importants qui influent sur la sensibilité EAE. Il convient de s'assurer que les conditions sont comparables entre les expériences indépendantes.
Comme décrit ci-dessus, le protocole mentionné peut être utilisé comme point de départ pour des expériences EAE adoptifs. Ce modèle est particulièrement adapté pour séparer les effets périphériques du système nerveux central et d'un phénotype génétique (par exemple par le transfert de cellules knock-out encéphalitogènes dans des souris receveuses de type sauvage) et pour des questions immunologiques spécifiques que le phénotype des cellules transférées peut être caractérisé en profondeur. Le dernier développement dans la recherche EAE au cours des dernières années sont des récepteurs de cellules T de souris transgéniques. Ces souris développent des symptômes EAE spontanément, sans influence extérieure contourner le problème de l'adjuvant inoculation. Cependant, ce modèle nécessite de grandes quantités d'animaux pour breeding à assurer la taille des groupes suffisantes. Évaluation des souris knock-out nécessite croisement avant expériences EAE contrairement à æÆ. Comme chaque souris développe des symptômes de la maladie à un jour différent, l'évaluation de nouvelles substances peut être assez compliqué. Par conséquent, la valeur de æÆ classique pour neuroimmunological demeure incontestée.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (IZKF) Münster (de la graine 03/12, SB).
Materials
| Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight | e.g. Jackson Laboratory, Charles River | ||
| MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) | e.g. Pepceuticals Ltd | Store at -20°C | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Sigma-Aldrich Co. | F5506 | Store at 4 °C. |
| Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle | e.g. Becton Dickinson & Co. | 309625 | |
| Syringes, 2 ml | e.g. B. Braun | 7389 | |
| Needles, 25G5/8 and 30G1/2 | e.g. Becton Dickinson & Co., | 305122, 305106 | |
| Three way halve | e.g. B. Braun | 16494 C | |
| Pertussis toxin, lyophilized in buffer | Enzo Life Sciences Inc. | BML-G100 | Store at 4 °C. |
| M. tuberculosis H37 RA | BD Difco | 231141 | Store at 4 °C. |
Referanslar
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