Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Microarray Amplificación

La detección temprana de los casos y el tratamiento rápido se consideran las estrategias de control más eficaces de reducir el Mycobacterium tuberculosis (MTB) de transmisión de ^1, y existe un amplio consenso en la comunidad TB que un punto de atención (PDA) o cerca de la prueba POC para diagnosticar simultáneamente TB y se necesita resistencia a los medicamentos (DR). Tecnologías tales como GeneXpert de Cepheid y otras pruebas de amplificación de ácidos nucleicos reducen el tiempo de diagnóstico para muchos pacientes de TB, y proporcionan una rápida lectura de salida que indica la resistencia a la rifampicina o mutaciones seleccionadas que confieren resistencia a otros fármacos de línea primero o segundo ^2. Aunque las pruebas de amplificación en tiempo real y de ácidos nucleicos isotérmica están diseñadas para identificar las mutaciones de resistencia a las drogas que llevan a la MDR-TB, el espectro de mutaciones se detectan es a menudo insuficiente para diseñar un régimen individualizado de drogas correspondiente al perfil de resistencia a los medicamentos del paciente, y las limitaciones técnicas relacionadasa la diafonía óptica o la complejidad de la amplificación y de información química ^{3 a 7 may} limitar el número de loci o mutaciones que se detectan. Por lo tanto, se requieren tecnologías de detección con mayor capacidad de multiplexación para subsanar las deficiencias conocidas en el diagnóstico POC MDR-TB.

Microarrays y los ensayos con sondas de línea Hain avaladas por la OMS pueden hacer frente a la "múltiples genes, mutaciones múltiples" reto de diagnosticar la TB-MR ^8-29. Por desgracia, estas plataformas de detección de multiplexado basado en la hibridación utilizan múltiples pasos, complicado y protocolos de amplificación de voces que exigen la formación y la competencia significativa en las técnicas moleculares. El microarray de amplificación ³⁰ fue diseñado para hacer frente a algunos de estos microarrays de flujo de trabajo y las preocupaciones operacionales. Los principios de fluidos simplificadoras son para amplificar, hibridar, y detectar dianas de ácido nucleico dentro de una cámara única de microfluidos. El usuario introduce los mas ácidos nucleicos y amplificaciónter la mezcla en una cámara de fluido con una pipeta y se inicia el protocolo de ciclado térmico. Para el método de procesamiento por lotes que se muestra aquí, los microarrays se lavan posteriormente en solución en masa, se secaron, y la imagen. Este estudio demuestra la funcionalidad de un microarray de amplificación utilizando una prueba de MDR-TB de microarrays para rpoB (30 mutaciones), katG (2 mutaciones), inh (4 mutaciones), rpsL (2 mutaciones), embB (1 mutación), IS1245, IS6110 , y una amplificación interna y el control de hibridación. Al menos un par emparejado de microarrays sondas (de tipo salvaje (WT) y mutantes de un solo nucleótido (MU)) se incluye para cada mutación de interés. Ácidos nucleicos purificados a partir de M. resistente a múltiples fármacos tuberculosis son de la cepa TDR Tuberculosis Banco ^31. Microarrays de elemento en gel se fabrican sobre substratos de vidrio por copolimerización esencialmente como se describe en otra parte ^32, excepto que se utiliza 4% de monómero y 0,05 mM de cada sonda en el polimerizablesmezcla ación. Las matrices están rodeados con una junta de 50 ml antes de su uso. Después de ciclos térmicos, de hibridación y de lavado de pasos, microarrays de amplificación se crean imágenes en un analizador portátil Akonni. , La intensidad de señal integrados antecedentes corregido se obtienen de la prima. Imágenes tif utilizando un algoritmo círculo fijo. De ruido para cada elemento de gel se calcula como tres veces la desviación estándar de los fondos contado locales. Objetivos de genes típicamente se consideran detectables durante la relación señal-ruido (SNR) valores ≥ 3. Con el fin de determinar la presencia o ausencia de una mutación específica en cada gen o codón, una relación discriminante se calcula a partir de los valores de SNR como (WT-MU) / (wt + MU). Ratios de discriminantes <0 son indicativos de una mutación de resistencia a fármacos en el locus, mientras que las relaciones> 0 son indicativos de la secuencia de tipo salvaje.