Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplificazione Microarray

Rilevamento caso precoce e un trattamento rapido sono considerate le strategie di controllo più efficaci per ridurre Mycobacterium tuberculosis (MTB) trasmissione ^1, e ora c'è un ampio consenso nella comunità TB che un punto di assistenza (POC) o in prossimità POC test per diagnosticare contemporaneamente TB ed è necessaria resistenza ai farmaci (DR). Tecnologie come GeneXpert di Cefeidi e di altri test di amplificazione degli acidi nucleici riducono il tempo di diagnosi per molti pazienti affetti da tubercolosi, e di fornire una rapida read-out che indica la resistenza alla rifampicina o mutazioni selezionate che conferiscono resistenza agli altri prima o farmaci di seconda linea ^2. Sebbene i test di amplificazione in tempo reale e di acido nucleico isotermica sono progettati per identificare le mutazioni di resistenza ai farmaci che portano a MDR-TB, lo spettro di mutazioni che scoprono è spesso insufficiente per progettare un regime individualizzato farmaco corrispondente al profilo farmacoresistenza del paziente, e vincoli tecnici connessidi ottica cross-talk o la complessità di amplificazione e di reporting chimiche ^{3-7 maggio} limitare il numero di loci o mutazioni che vengono rilevati. Così, tecnologie di rilevazione con una maggiore capacità di multiplexing sono necessari per colmare le lacune note nella diagnostica POC MDR-TB.

Microarray e le Hain saggi sonda linea OMS-omologati possono affrontare il "gene multipla, mutazioni multiple" sfida di diagnosticare MDR-TB ^8-29. Purtroppo, questi, piattaforme di rilevamento multiplex a base di ibridazione-usano più fasi, complicato, e protocolli open-ampliconi che richiedono una formazione significativa e competenza in tecniche molecolari. Il microarray di amplificazione ³⁰ è stato progettato per affrontare alcuni di questi microarray flusso di lavoro e le preoccupazioni operative. I principi fluidici di semplificazione sono per amplificare, ibridare, e individuare gli obiettivi di acido nucleico all'interno di una singola camera di microfluidica. L'utente introduce i mas acidi e amplificazione dell'acido nucleicoter miscela in una camera fluidico con una pipetta e attiva il protocollo di cicli termici. Per il metodo di elaborazione batch mostrato qui, microarrays sono successivamente lavati in soluzione bulk, essiccati, e ripreso. Questo studio dimostra la funzionalità di un microarray di amplificazione mediante test di MDR-TB microarray per rpoB (30 mutazioni), katG (2 mutazioni), inhA (4 mutazioni), rpsL (2 mutazioni), embB (1 mutazione), IS1245, IS6110 , e un amplificazione interna e controllo ibridazione. Almeno una coppia di sonde microarray (di tipo selvatico (WT) e single-nucleotide mutanti (MU)) è incluso per ogni mutazione di interesse. Acidi nucleici purificati da multi-farmaco resistente M. tubercolosi sono dal ceppo TDR Tubercolosi Bank ^31. Microarrays elemento Gel sono realizzati su substrati di vetro per copolimerizzazione essenzialmente come descritto altrove ^32, tranne che usiamo 4% monomero e 0,05 mm ciascuna sonda nel polymerizmiscela zione. Array sono circondati da una guarnizione 50 ml prima dell'uso. Dopo cicli termici, di ibridazione e di lavaggio gradini, microarrays amplificazione vengono esposte su un analizzatore portatile Akonni. , Intensità di segnale integrati Sfondo correzione sono ottenuti dal greggio. Immagini tif utilizzando un algoritmo cerchio fisso. Rumore per ciascun elemento gel è calcolato come tre volte la deviazione standard degli sfondi posto locale. Obiettivi del gene sono in genere considerati rilevabile per il rapporto segnale-rumore (SNR) valori ≥ 3. Per determinare la presenza o l'assenza di una specifica mutazione in ogni gene o codone, un rapporto discriminante è calcolato dai valori SNR (WT-MU) / (WT + MU). Rapporti discriminanti <0 sono indicativi di un farmaco-resistenza mutazione al locus, mentre i rapporti> 0 sono indicativi della sequenza wild-type.